本文選題：糖尿病腎病　切入點(diǎn)：自噬　出處：《西南醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:20%~40%糖尿病患者可能會發(fā)生糖尿病腎病,最后發(fā)展為腎功能衰竭尿毒癥。強(qiáng)化血糖控制可以延緩糖尿病腎病的發(fā)生,但高血糖狀態(tài)下引起腎臟病變的機(jī)制尚未明確。目前研究表明自噬參與了糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展,自噬可以降解衰老的細(xì)胞器、多余的蛋白、有害的細(xì)胞質(zhì)成分,有研究表明糖尿病腎病的小鼠比正常小鼠自噬水平低。調(diào)節(jié)自噬信號最經(jīng)典的負(fù)調(diào)控信號途徑是P13K-Akt-mTOR,mTOR可作為FBW7的底物蛋白,能被泛素化修飾并被蛋白酶體降解,FBW7是SCF型(Skp1 Cullin1 F-box protein)E3泛素連接酶的識別亞基。糖尿病mTOR信號分子究竟如何表達(dá),FBW7是否參與了對mTOR信號通路的調(diào)節(jié)進(jìn)而參與了糖尿病腎病的發(fā)生?為此,我們體外培養(yǎng)腎系膜細(xì)胞,研究高糖對FBW7表達(dá)的影響及其對自噬信號的調(diào)控作用,為深入研究糖尿病腎病提供新的理論依據(jù)。方法:(1)不同濃度葡萄糖對腎系膜細(xì)胞FBW7、LC3-II/I、mTOR、p-mTOR、I型膠原蛋白(Col-I)、IL-1β、caspase-1表達(dá)以及自噬溶酶體的影響:將小鼠腎系膜細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)72h,分組如下(1)正常糖組(NC);(2)滲透壓對照組(OP);(3)高糖干預(yù)組(10mmol/L葡萄糖,HG1組);(4)高糖干預(yù)組(20mmol/L葡萄糖,HG2組);(5)高糖干預(yù)組(30mmol/L葡萄糖,HG3組)。采用western blot檢測FBW7、mTOR、p-mTOR的表達(dá)水平以及LC3-II/I比值,采用RT-PCR進(jìn)一步檢測FBW7的mRNA水平;采用激光共聚焦顯微鏡檢測自噬溶酶體;采用ELISA檢測Col-I、IL-1β、caspase-1表達(dá)。(2)不同時間高糖對腎系膜細(xì)胞lc3-ii/i、fbw7、mtor、p-mtor、自噬溶酶體、col-i、il-1β、caspase-1表達(dá)的影響:以5.6mmol/l葡萄糖為對照,用30mmol/l高糖分別對小鼠腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞干預(yù)2h、6h、12h、24h、48h、72h,并采用上述技術(shù)檢測相關(guān)蛋白水平及自噬水平。(3)雷帕霉素干預(yù)對腎系膜細(xì)胞mtor、p-mtor、lc3-ii/i、col-i、il-1β、caspase-1、自噬溶酶體的影響:將小鼠腎小球系膜細(xì)胞體外培養(yǎng)72h,使用雷帕霉素抑制mtor。分組如下(1)nc組;(2)nc-rapa3組;(3)hg3組;(4)hg3-rapa3組。采用上述技術(shù)檢測相關(guān)蛋白水平及自噬水平。(4)基因沉默fbw7對系膜細(xì)胞mtor、p-mtor、lc3-ii/i、自噬溶酶體、col-i、il-1β、caspase-1表達(dá)的影響:選擇自噬最強(qiáng)的條件進(jìn)行基因沉默fbw7,分組如下(1)nc組;(2)nc-sifbw7組;(3)hg3組;(4)hg3-sifbw7組。采用上述技術(shù)檢測相關(guān)蛋白水平及自噬水平。(5)過表達(dá)fbw7對系膜細(xì)胞fbw7、lc3-ii/i、mtor、p-mtor、自噬溶酶體、col-i、il-1β、caspase-1表達(dá)的影響:選擇自噬最弱的條件進(jìn)行過表達(dá)fbw7實(shí)驗(yàn),分組如下(1)nc-lv-con238組;(2)nc-lv-fbw7組;(3)hg3-lv-con238組;(4)hg3-lv-fbw7組。采用上述技術(shù)檢測相關(guān)蛋白水平及自噬水平。結(jié)果:(1)以不同濃度的葡萄糖持續(xù)刺激小鼠腎小球系膜細(xì)胞72小時,發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度越高,fbw7、lc3-ii/i比值和自噬溶酶體表達(dá)水平越低,mtor、p-mtor、col-i、il-1β、caspase-1的表達(dá)水平越高(p0.05)。(2)30mmol/l高糖分別對小鼠腎系膜細(xì)胞刺激2h、6h、12h、24h、48h、72h,發(fā)現(xiàn)12h組fbw7、lc3-ii/i比值和自噬溶酶體顯著增加,mtor和p-mtor蛋白表達(dá)顯著減少(p0.05)。72h組fbw7、lc3-ii/i比值和自噬溶酶體表達(dá)顯著減少,mtor和p-mtor、col-i、il-1β、caspase-1表達(dá)顯著增加(P0.05)。自噬活性最強(qiáng)的刺激條件30 mmol/L葡萄糖刺激12小時,自噬活性最弱的條件是30 mmol/L葡萄糖刺激72小時。(3)雷帕霉素干預(yù)高糖刺激的腎系膜細(xì)胞,mTOR、p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表達(dá)顯著減少,LC3-II/I比值顯著增加,自噬溶酶體數(shù)目顯著增加(P0.05)。(4)基因沉默F(xiàn)BW7可使FBW7、LC3-II/I比值顯著減少,mTOR和p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表達(dá)顯著增加,自噬溶酶體數(shù)目顯著減少(P0.05)。(5)過表達(dá)FBW7實(shí)驗(yàn)可使FBW7、LC3-II/I比值顯著增加,mTOR和p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表達(dá)顯著減少,自噬溶酶體數(shù)目顯著增加(P0.05)。結(jié)論:1.短時間的高糖刺激可以上調(diào)FBW7表達(dá),抑制mTOR,引起小鼠腎系膜細(xì)胞自噬活性增強(qiáng),可能對早期糖尿病腎臟有保護(hù)作用。2.長時間高糖刺激可以下調(diào)FBW7表達(dá)激活mTOR,引起小鼠腎系膜細(xì)胞自噬水平的降低,可能參與腎臟炎癥和纖維化的形成。3.FBW7可能通過調(diào)控腎系膜細(xì)胞自噬水平參與了糖尿病腎病的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1604460