本文關鍵詞： miR-141 破骨細胞 CALCR 骨質疏松 恒河猴　出處：《華南農業(yè)大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：骨質疏松癥是一種全球性的疾病。雖然治療骨質疏松癥的藥物多種多樣,但是仍然存在許多缺陷。因此,研發(fā)治療骨質疏松的新藥物成為一個亟待解決的科學問題。本文旨在探索miR-141在恒河猴骨質疏松中的治療作用及其作用機制,從而為治療骨質疏松癥開辟新的研究方向。首先,我們收集了23例69歲以上老年女性的骨骼樣本,對這些骨骼樣品中miR-141的水平和骨密度進行了檢測。同時,我們還收集了32只12歲以上的恒河猴骨骼樣本,檢測其miR-141水平和骨密度。我們還構建了3只卵巢摘除所致的恒河猴骨質疏松模型,檢測了該模型中的miR-141的水平變化。進一步選擇了12只18歲以上的老年雌性恒河猴作為絕經期后骨質疏松案例,檢測了這些恒河猴的體重、腰椎與髖骨的骨密度和血清中NTx(I型膠原交聯(lián)N端肽)、CTx(I型膠原交聯(lián)C端肽)、TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)的含量。隨后,隨機將12只恒河猴分成2組,每周通過靜脈給予實驗組或對照組20 mg/kg的miR-NC(對照組)或miR-141模擬物(實驗組)。每兩周對恒河猴的行為和體重進行記錄,同時對其骨密度進行CT檢測,并抽取3mL外周血進行血清中的骨吸收指標NTx、CTx和TRAP5b含量進行檢測。12周給藥之后對分別對對照組和實驗組恒河猴進行安樂死,取其心、肝、脾、腎、腰椎、髖骨和下肢骨。對其心、肝、脾、腎進行HE染色觀察其病理學變化;對脛骨進行microCT檢測其骨密度變化;對腰椎和髖骨進行HE、TRAP染色檢測骨小梁和破骨細胞的變化。另外,我們抽取雌性恒河猴骨髓,分離骨髓單核巨噬細胞,利用M-CSF(50ng/mL)和RANKL(100ng/mL)誘導破骨細胞體外分化。在分化過程中轉染miR-NC、miR-141或其抑制劑(Anti-miR-NC和Anti-miR-141),利用Q-PCR技術檢測破骨細胞分化的特異基因TNFRSF11A、TRAP、CTSK的表達水平。同時,對體外培養(yǎng)的細胞進行TRAP染色。我們還通過軟件預測了miR-141的靶基因,并將該基因的3’UTR區(qū)域克隆到雙熒光報告載體中。將克隆有靶基因3’UTR的雙熒光報告載體與miR-NC、miR-141和miR-141突變體(miR-141-MUT1和miR-141-MUT2)共轉染到恒河猴破骨細胞中,檢測熒光素酶活性的變化。同時用Q-PCR技術檢測CALCR的m RNA水平的變化,用Western blot技術檢測在此過程中靶基因的蛋白含量的變化。最后檢測了miR-NC組和miR-141組恒河猴骨骼中miR-141靶基因蛋白的含量變化。實驗結果表明,人和恒河猴骨骼樣本中miR-141的水平和骨密度成正相關關系,并且在卵巢摘除骨質疏松動物模型中miR-141的水平也明顯下降。將miR-141給予老年雌性恒河猴12周,其脛骨、髖骨和腰椎的骨密度明顯增加,進一步對腰椎和髖骨的HE染色同樣發(fā)現(xiàn)其骨小梁的數(shù)量,厚度,骨體積都有明顯增加。在實驗過程中實驗組和對照組的恒河猴并沒有表現(xiàn)出明顯的行為差異,也沒有表現(xiàn)出明顯的體重變化。對實驗組恒河猴的主要器官組織進行HE染色未見明顯病理變化。相對對照組,實驗組恒河猴的髖骨和腰椎的破骨細胞的數(shù)量、破骨細胞所占面積都有明顯增加。對恒河猴的破骨細胞進行體外誘導過表達或抑制miR-141后,發(fā)現(xiàn)破骨細胞分化的特異基因表達水平明顯下降或升高,并且通過TRAP染色,進一步揭示多核破骨細胞的數(shù)量明顯下降或上升。最后我們預測了miR-141的靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-141靶向CALCR的3’UTR區(qū)域。通過雙熒光報告系統(tǒng)檢測,我們發(fā)現(xiàn)miR-141能夠抑制克隆有CALCR3’UTR的雙熒光報告載體的熒光素酶活性。同時Q-PCR檢測結果表明miR-141的抑制劑不能夠引起明顯的CALCR的mRNA水平變化,但是miR-141可以明顯的抑制CALCR蛋白的表達量。研究結果表明給予miR-141能夠有效地緩解老年雌性恒猴的骨量丟失,從而為治療骨質疏提供了一個新治療方向。
[Abstract]:In order to explore the therapeutic effect and mechanism of miR - 141 in the osteoporosis of rhesus monkeys , the changes of miR - 141 levels and bone density were detected by HE and TRAP staining . The results showed that miR - 141 could inhibit the expression of CALCR protein . At the same time , we found that miR - 141 could inhibit the expression of CALCR . At the same time , we found that miR - 141 could inhibit the expression of CALCR protein .

【學位授予單位】：華南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R580

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本文編號：1512966