本文關(guān)鍵詞： miR-141 破骨細(xì)胞 CALCR 骨質(zhì)疏松 恒河猴　出處：《華南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：骨質(zhì)疏松癥是一種全球性的疾病。雖然治療骨質(zhì)疏松癥的藥物多種多樣,但是仍然存在許多缺陷。因此,研發(fā)治療骨質(zhì)疏松的新藥物成為一個(gè)亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。本文旨在探索miR-141在恒河猴骨質(zhì)疏松中的治療作用及其作用機(jī)制,從而為治療骨質(zhì)疏松癥開(kāi)辟新的研究方向。首先,我們收集了23例69歲以上老年女性的骨骼樣本,對(duì)這些骨骼樣品中miR-141的水平和骨密度進(jìn)行了檢測(cè)。同時(shí),我們還收集了32只12歲以上的恒河猴骨骼樣本,檢測(cè)其miR-141水平和骨密度。我們還構(gòu)建了3只卵巢摘除所致的恒河猴骨質(zhì)疏松模型,檢測(cè)了該模型中的miR-141的水平變化。進(jìn)一步選擇了12只18歲以上的老年雌性恒河猴作為絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松案例,檢測(cè)了這些恒河猴的體重、腰椎與髖骨的骨密度和血清中NTx(I型膠原交聯(lián)N端肽)、CTx(I型膠原交聯(lián)C端肽)、TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)的含量。隨后,隨機(jī)將12只恒河猴分成2組,每周通過(guò)靜脈給予實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M20 mg/kg的miR-NC(對(duì)照組)或miR-141模擬物(實(shí)驗(yàn)組)。每?jī)芍軐?duì)恒河猴的行為和體重進(jìn)行記錄,同時(shí)對(duì)其骨密度進(jìn)行CT檢測(cè),并抽取3mL外周血進(jìn)行血清中的骨吸收指標(biāo)NTx、CTx和TRAP5b含量進(jìn)行檢測(cè)。12周給藥之后對(duì)分別對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組恒河猴進(jìn)行安樂(lè)死,取其心、肝、脾、腎、腰椎、髖骨和下肢骨。對(duì)其心、肝、脾、腎進(jìn)行HE染色觀察其病理學(xué)變化;對(duì)脛骨進(jìn)行microCT檢測(cè)其骨密度變化;對(duì)腰椎和髖骨進(jìn)行HE、TRAP染色檢測(cè)骨小梁和破骨細(xì)胞的變化。另外,我們抽取雌性恒河猴骨髓,分離骨髓單核巨噬細(xì)胞,利用M-CSF(50ng/mL)和RANKL(100ng/mL)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞體外分化。在分化過(guò)程中轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-141或其抑制劑(Anti-miR-NC和Anti-miR-141),利用Q-PCR技術(shù)檢測(cè)破骨細(xì)胞分化的特異基因TNFRSF11A、TRAP、CTSK的表達(dá)水平。同時(shí),對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色。我們還通過(guò)軟件預(yù)測(cè)了miR-141的靶基因,并將該基因的3’UTR區(qū)域克隆到雙熒光報(bào)告載體中。將克隆有靶基因3’UTR的雙熒光報(bào)告載體與miR-NC、miR-141和miR-141突變體(miR-141-MUT1和miR-141-MUT2)共轉(zhuǎn)染到恒河猴破骨細(xì)胞中,檢測(cè)熒光素酶活性的變化。同時(shí)用Q-PCR技術(shù)檢測(cè)CALCR的m RNA水平的變化,用Western blot技術(shù)檢測(cè)在此過(guò)程中靶基因的蛋白含量的變化。最后檢測(cè)了miR-NC組和miR-141組恒河猴骨骼中miR-141靶基因蛋白的含量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,人和恒河猴骨骼樣本中miR-141的水平和骨密度成正相關(guān)關(guān)系,并且在卵巢摘除骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型中miR-141的水平也明顯下降。將miR-141給予老年雌性恒河猴12周,其脛骨、髖骨和腰椎的骨密度明顯增加,進(jìn)一步對(duì)腰椎和髖骨的HE染色同樣發(fā)現(xiàn)其骨小梁的數(shù)量,厚度,骨體積都有明顯增加。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的恒河猴并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的行為差異,也沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的體重變化。對(duì)實(shí)驗(yàn)組恒河猴的主要器官組織進(jìn)行HE染色未見(jiàn)明顯病理變化。相對(duì)對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組恒河猴的髖骨和腰椎的破骨細(xì)胞的數(shù)量、破骨細(xì)胞所占面積都有明顯增加。對(duì)恒河猴的破骨細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)或抑制miR-141后,發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞分化的特異基因表達(dá)水平明顯下降或升高,并且通過(guò)TRAP染色,進(jìn)一步揭示多核破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯下降或上升。最后我們預(yù)測(cè)了miR-141的靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-141靶向CALCR的3’UTR區(qū)域。通過(guò)雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)miR-141能夠抑制克隆有CALCR3’UTR的雙熒光報(bào)告載體的熒光素酶活性。同時(shí)Q-PCR檢測(cè)結(jié)果表明miR-141的抑制劑不能夠引起明顯的CALCR的mRNA水平變化,但是miR-141可以明顯的抑制CALCR蛋白的表達(dá)量。研究結(jié)果表明給予miR-141能夠有效地緩解老年雌性恒猴的骨量丟失,從而為治療骨質(zhì)疏提供了一個(gè)新治療方向。
[Abstract]:In order to explore the therapeutic effect and mechanism of miR - 141 in the osteoporosis of rhesus monkeys , the changes of miR - 141 levels and bone density were detected by HE and TRAP staining . The results showed that miR - 141 could inhibit the expression of CALCR protein . At the same time , we found that miR - 141 could inhibit the expression of CALCR . At the same time , we found that miR - 141 could inhibit the expression of CALCR protein .

【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R580

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