本文關鍵詞： siRNA RasGRP3 B淋巴細胞 p-Erk p-Akt B細胞 RasGRP3 IL-6 TNFa caspase3　出處：《華中科技大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分 干擾正常人外周血B細胞和系統(tǒng)性紅斑狼瘡鼠MZ FO B細胞中RasGRP3的表達對下游信號通路的影響 目的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種典型的自身免疫性疾病,其特點是自身免疫耐受缺失產(chǎn)生大量自身抗體導致多器官功能受損。內源性自身反應性B淋巴細胞是SLE發(fā)病的重要環(huán)節(jié),其發(fā)病機制之一B細胞受體(B cell receptor, BCR)通路的高度活化。Ras鳥苷酸釋放蛋白3(Rasguanylnucleotide releasing protein3, RasGRP3)作為BCR信號通路下游重要分子主要在B細胞中表達。在前期實驗中我們已證明系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者PBMC及B細胞中RasGRP3的mRNA和蛋白質水平均較正常人明顯升高,提示RasGRP3在PBMC及B細胞中的異常表達可能參與狼瘡發(fā)病。本實驗用siRNA干擾RasGRP3在正常人外周血B細胞及狼瘡鼠MZ FO B細胞中的表達,研究RasGRP3的表達水平對下游信號通路活化的影響,探討RasGRP3參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病的機制。 方法收集正常志愿者外周血3例及MRL/1pr.B6狼瘡鼠脾臟3例。分別通過Ficoll法及研磨法提取正常人PBMC及MRL/1pr.B6狼瘡鼠脾臟細胞,然后采用磁珠分選法純化B細胞。通過電轉染使siRNA干擾B細胞。T通過逆轉錄PCR方法和Western Blot方法檢測RasGRP3在正常人B細胞和狼瘡鼠脾臟MZFOB細胞中的mRNA及蛋白的表達。siRNA干擾細胞40h后,使用anti-IgM, CD40L和人重組IL-4刺激人外周血B細胞,anti-IgM, anti-CD40和鼠重組IL-4刺激狼瘡鼠MZFOB細胞,在刺激時間為0min和30min時提取細胞。通過western blot方法檢測RasGRP3蛋白水平和下游信號分子Erk, Akt以及各蛋白分子磷酸化的水平。 結果無論是正常人B細胞還是狼瘡鼠MZ FO B細胞,siRNA干擾后細胞中RasGRP3mRNA和蛋白的表達均叫顯低于scramble組。刺激30min后,RasGRP3siRNA組Erk, Akt磷酸化水平明顯低于Scramble siRNA組。 結論通過電轉染的方法可以使siRNA成功干擾正常人B細胞及狼瘡鼠MZ FO B細胞中RasGRP3mRNA和蛋白質的表達。正常人外周血B細胞及狼瘡鼠MZ FOB細胞中RasGRP3表達水平降低可以下調其下游信號分子Erk和Akt磷酸化水平,這也許是RasGRP3參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病的機制之一 第二部分 干擾系統(tǒng)性紅斑狼瘡鼠MZFOB細胞中RasGRP3的表達對分泌炎性細胞因子及細胞凋亡的影響 目的研究沉默RasGRP3后MRL/1pr.B6良瘡鼠MZFOB細胞分泌細胞因子及表達凋亡蛋白的情況,進一步探討RasGRP3參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機制。 方法收集MRL/1pr.B6狼瘡鼠脾臟3例。通過研磨法提取狼瘡鼠脾臟細胞,然后采用磁珠分選純化狼瘡鼠脾臟MZ FO B細胞。通過電轉染siRNA法干擾狼瘡鼠脾臟MZFOB細胞RasGRP3的表達。細胞電轉染20h后用anti-IgM, anti-CD40和鼠重組IL-4刺激狼瘡鼠MZ FO B細胞,在刺激時間為0h和6h時提取細胞。使用realtime PCR方法檢測MZ FO B細胞內IL-6及TNFa的mRNA水平。細胞電轉染40小時后提取細胞,用western blot法明確凋亡蛋白caspase3及cleaved caspase3活化片段的表達。 結果刺激6h后較刺激前MZ FO B細胞內IL-6和TNFa的mRNA表達明顯升高,但RasGRP3siRNA組MZFOB細胞內IL-6和TNFa的mRNA明顯低于scramble組。siRNA干擾40h后siRNA組MZ FO B細胞caspase3活化片段的表達明顯高于scramble組。 結論RasGRP3表達降低導致狼瘡鼠MZFOB細胞內促炎性因子IL-6和TNFa的mRNA水平降低,同時增加細胞內凋亡蛋白的表達。由此提示RasGRP3可以抑制B細胞分泌炎性細胞因子并促進B細胞凋亡,從而參與狼瘡的發(fā)生。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R593.241

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1 夏穎;系統(tǒng)性紅斑狼瘡中RasGRP3通過調節(jié)Ras信號通路活化影響B(tài)細胞分泌細胞因子及凋亡[D];華中科技大學;2015年

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本文編號：1510755