本文關(guān)鍵詞： siRNA RasGRP3 B淋巴細(xì)胞 p-Erk p-Akt B細(xì)胞 RasGRP3 IL-6 TNFa caspase3　出處：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分 干擾正常人外周血B細(xì)胞和系統(tǒng)性紅斑狼瘡鼠MZ FO B細(xì)胞中RasGRP3的表達(dá)對(duì)下游信號(hào)通路的影響 目的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種典型的自身免疫性疾病,其特點(diǎn)是自身免疫耐受缺失產(chǎn)生大量自身抗體導(dǎo)致多器官功能受損。內(nèi)源性自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞是SLE發(fā)病的重要環(huán)節(jié),其發(fā)病機(jī)制之一B細(xì)胞受體(B cell receptor, BCR)通路的高度活化。Ras鳥(niǎo)苷酸釋放蛋白3(Rasguanylnucleotide releasing protein3, RasGRP3)作為BCR信號(hào)通路下游重要分子主要在B細(xì)胞中表達(dá)。在前期實(shí)驗(yàn)中我們已證明系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者PBMC及B細(xì)胞中RasGRP3的mRNA和蛋白質(zhì)水平均較正常人明顯升高,提示RasGRP3在PBMC及B細(xì)胞中的異常表達(dá)可能參與狼瘡發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)用siRNA干擾RasGRP3在正常人外周血B細(xì)胞及狼瘡鼠MZ FO B細(xì)胞中的表達(dá),研究RasGRP3的表達(dá)水平對(duì)下游信號(hào)通路活化的影響,探討RasGRP3參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病的機(jī)制。 方法收集正常志愿者外周血3例及MRL/1pr.B6狼瘡鼠脾臟3例。分別通過(guò)Ficoll法及研磨法提取正常人PBMC及MRL/1pr.B6狼瘡鼠脾臟細(xì)胞,然后采用磁珠分選法純化B細(xì)胞。通過(guò)電轉(zhuǎn)染使siRNA干擾B細(xì)胞。T通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR方法和Western Blot方法檢測(cè)RasGRP3在正常人B細(xì)胞和狼瘡鼠脾臟MZFOB細(xì)胞中的mRNA及蛋白的表達(dá)。siRNA干擾細(xì)胞40h后,使用anti-IgM, CD40L和人重組IL-4刺激人外周血B細(xì)胞,anti-IgM, anti-CD40和鼠重組IL-4刺激狼瘡鼠MZFOB細(xì)胞,在刺激時(shí)間為0min和30min時(shí)提取細(xì)胞。通過(guò)western blot方法檢測(cè)RasGRP3蛋白水平和下游信號(hào)分子Erk, Akt以及各蛋白分子磷酸化的水平。 結(jié)果無(wú)論是正常人B細(xì)胞還是狼瘡鼠MZ FO B細(xì)胞,siRNA干擾后細(xì)胞中RasGRP3mRNA和蛋白的表達(dá)均叫顯低于scramble組。刺激30min后,RasGRP3siRNA組Erk, Akt磷酸化水平明顯低于Scramble siRNA組。 結(jié)論通過(guò)電轉(zhuǎn)染的方法可以使siRNA成功干擾正常人B細(xì)胞及狼瘡鼠MZ FO B細(xì)胞中RasGRP3mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。正常人外周血B細(xì)胞及狼瘡鼠MZ FOB細(xì)胞中RasGRP3表達(dá)水平降低可以下調(diào)其下游信號(hào)分子Erk和Akt磷酸化水平,這也許是RasGRP3參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病的機(jī)制之一 第二部分 干擾系統(tǒng)性紅斑狼瘡鼠MZFOB細(xì)胞中RasGRP3的表達(dá)對(duì)分泌炎性細(xì)胞因子及細(xì)胞凋亡的影響 目的研究沉默RasGRP3后MRL/1pr.B6良瘡鼠MZFOB細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及表達(dá)凋亡蛋白的情況,進(jìn)一步探討RasGRP3參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制。 方法收集MRL/1pr.B6狼瘡鼠脾臟3例。通過(guò)研磨法提取狼瘡鼠脾臟細(xì)胞,然后采用磁珠分選純化狼瘡鼠脾臟MZ FO B細(xì)胞。通過(guò)電轉(zhuǎn)染siRNA法干擾狼瘡鼠脾臟MZFOB細(xì)胞RasGRP3的表達(dá)。細(xì)胞電轉(zhuǎn)染20h后用anti-IgM, anti-CD40和鼠重組IL-4刺激狼瘡鼠MZ FO B細(xì)胞,在刺激時(shí)間為0h和6h時(shí)提取細(xì)胞。使用realtime PCR方法檢測(cè)MZ FO B細(xì)胞內(nèi)IL-6及TNFa的mRNA水平。細(xì)胞電轉(zhuǎn)染40小時(shí)后提取細(xì)胞,用western blot法明確凋亡蛋白caspase3及cleaved caspase3活化片段的表達(dá)。 結(jié)果刺激6h后較刺激前MZ FO B細(xì)胞內(nèi)IL-6和TNFa的mRNA表達(dá)明顯升高,但RasGRP3siRNA組MZFOB細(xì)胞內(nèi)IL-6和TNFa的mRNA明顯低于scramble組。siRNA干擾40h后siRNA組MZ FO B細(xì)胞caspase3活化片段的表達(dá)明顯高于scramble組。 結(jié)論RasGRP3表達(dá)降低導(dǎo)致狼瘡鼠MZFOB細(xì)胞內(nèi)促炎性因子IL-6和TNFa的mRNA水平降低,同時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的表達(dá)。由此提示RasGRP3可以抑制B細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子并促進(jìn)B細(xì)胞凋亡,從而參與狼瘡的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R593.241

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1 夏穎;系統(tǒng)性紅斑狼瘡中RasGRP3通過(guò)調(diào)節(jié)Ras信號(hào)通路活化影響B(tài)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及凋亡[D];華中科技大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1510755