發(fā)布時間：2018-02-07 09:21

  本文關(guān)鍵詞： Chemerin p38 MAPK 腎小球內(nèi)皮細(xì)胞 糖尿病腎病 炎癥因子　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)最為重要的原因之一。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(glomerular endothelial cell,GEn C)是腎小球濾過屏障必不可少的組成成分,其對于限制蛋白尿的產(chǎn)生,維持正常腎功能均具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn),高糖環(huán)境可誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng),引起相應(yīng)的功能障礙。探討內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生原因?qū)N發(fā)病機制的理解及臨床治療具有重要意義。Chemerin是1997年發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子,在體內(nèi)多種細(xì)胞均有表達(dá),且與脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等密切相關(guān)。其分泌入血后具有調(diào)節(jié)全身及局部炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)白細(xì)胞趨化的作用。Chem R23是最主要的識別Chemerin的受體。研究證實Chemerin主要通過Chem R23激活細(xì)胞內(nèi)多種信號通路,引起下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄,造成組織炎性損傷。但目前為止,二者在DN腎小球內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用尚未明確。目的1.觀察高糖環(huán)境下小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞Chemerin、Chem R23及炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)變化。2.沉默Chemerin受體Chem R23的表達(dá)后應(yīng)用Chemerin刺激細(xì)胞,觀察炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)變化。3.沉默Chemerin受體Chem R23的表達(dá)后,觀察高糖誘導(dǎo)下炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)變化。4.通過抑制p38 MAPK的磷酸化,觀察炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)變化。方法以條件永生化小鼠GEnCs為研究對象1.體外培養(yǎng)小鼠GEnCs并分成四組:正常對照組(葡萄糖:5.6mmol/L)、20mmol/L高糖組、40mmol/L高糖組、滲透壓對照組(5.6mmol/L葡萄糖+34.4mmol/L甘露醇),不同培養(yǎng)基作用24h后進(jìn)行檢測。Western Blot檢測細(xì)胞Chemerin、Chem R23、TNF-α、IL-6蛋白的表達(dá)水平,ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平,q RT-PCR檢測細(xì)胞Chemerin、Chem R23、TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平。2.構(gòu)建針對Chem R23的慢病毒載體,將慢病毒載體和空載體分別轉(zhuǎn)染入小鼠GEnCs后,給予Chemerin刺激,共分為四組:正常對照組、Chemerin刺激組、Chemerin+空載體組、Chemerin+sh RNA干擾組。培養(yǎng)一定時間后進(jìn)行檢測。Western Blot檢測Chem R23蛋白表達(dá)水平,ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平,q RT-PCR檢測細(xì)胞TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平。3.將慢病毒載體和空載體分別轉(zhuǎn)染入高糖下培養(yǎng)的小鼠GEnCs,共分為四組:正常對照組、高糖組、高糖+空載體組、高糖+sh RNA干擾組。培養(yǎng)一定時間后進(jìn)行檢測。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平,q RT-PCR檢測細(xì)胞TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平,Western Blot檢測p38MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)水平。4.體外培養(yǎng)小鼠GEnCs,高糖刺激前加入p38 MAPK抑制劑SB203580,共分為三組:正常對照組、高糖組、高糖+抑制劑組。培養(yǎng)一定時間后,ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平,q RT-PCR檢測細(xì)胞TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果1.高糖環(huán)境下小鼠GEnCs中Chemerin、Chem R23及炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)變化。與正常對照相比,高糖組GEnCs中炎癥因子IL-6及TNF-α的表達(dá)顯著升高(P0.05),同時Chemerin表達(dá)水平明顯升高(P0.05),但Chem R23表達(dá)無明顯變化(P0.05),滲透壓對照組均無改變(P0.05)。2.慢病毒載體干擾Chem R23表達(dá)后Chemerin作用下小鼠GEnCs中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)變化。使用針對Chem R23的sh RNA慢病毒干擾Chem R23表達(dá)后應(yīng)用Chemerin刺激細(xì)胞,Chemerin刺激組IL-6及TNF-α表達(dá)明顯升高(P0.05),與Chemerin+空載體組相比,Chemerin+sh RNA干擾組IL-6及TNF-α水平明顯下降(P0.05)。3.慢病毒載體干擾Chem R23表達(dá)后高糖誘導(dǎo)下小鼠GEnCs中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)變化和p38 MAPK信號通路的活化情況。干擾Chem R23表達(dá)后,與高糖+空載體組相比,高糖+sh RNA干擾組IL-6及TNF-α水平明顯下降(P0.05)。高糖組p38 MAPK磷酸化水平明顯升高(P0.05),提示p38 MAPK活化增強。與高糖+空載體組相比,高糖+sh RNA干擾組p-p38MAPK水平顯著降低(P0.05)。4.使用p38 MAPK特異性抑制劑SB203580,小鼠GEnCs中的炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)變化。與高糖組相比,高糖+抑制劑組IL-6及TNF-α水平顯著降低(P0.05)。結(jié)論1.高糖刺激可誘導(dǎo)GEnCs合成Chemerin。2.Chemerin通過結(jié)合其受體Chem R23可引起p38 MAPK信號通路的活化,從而誘導(dǎo)炎癥因子IL-6及TNF-α等的表達(dá),促進(jìn)GEnCs的炎癥反應(yīng)。3.干預(yù)Chem R23可抑制高糖引起的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R692.9

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本文編號：1494040