本文關(guān)鍵詞： 微管相關(guān)蛋白輕鏈3 哺乳動物ATG6同源蛋白) B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白 B細胞淋巴瘤/白細胞基因伴隨蛋白x 3-甲基腺嘌呤 氟中毒 肝臟 成骨細胞　出處：《貴州醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:研究慢性氟中毒大鼠肝臟組織、成骨組織及染氟大鼠原代成骨細胞中自噬相關(guān)因子LC3A、Beclin-1及凋亡因子Bcl-2、Bax的蛋白及其m RNA的表達水平;探討自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methy ladenine,3-MA))與自噬、凋亡的相互關(guān)系,以及氟中毒損傷成骨細胞機制。方法:1.將36只健康SD大鼠按體重隨機分為對照組、低氟組、高氟組,分別用含氟量1mg/L的自來水和含氟5、50mg/L的含氟水飼養(yǎng)6個月,觀察氟斑牙形成情況;測定尿氟、骨氟含量以及大鼠肝功能;蘇木素-伊紅染色觀察肝臟病理學改變;免疫組織化學法(immunohistochemistry,IHC)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot,WB)法檢測大鼠肝臟組織、成骨組織中微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3A,LC3A)、哺乳動物ATG6同源蛋白(a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30,Beclin-1)及B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell leukemia/lymphoma 2,Bcl-2)、B細胞淋巴瘤/白細胞基因伴隨蛋白x(Bcl-2 associated x protein,Bax)的蛋白表達水平。2.原代培養(yǎng)SD乳鼠顱骨中的成骨細胞(Osteoblast,OB),采用CCK-8法分別檢測氟化鈉、3-MA的適合濃度以及時間段,原代細胞傳至第三代后分成6組:對照組:含氟量為0mg/L、實驗組:染氟(氟化鈉Na F)分別為2.5(低氟組)、5(高氟組)mg/L,對照+3-MA組、低氟+3-MA組、高氟+3-MA組。WB和實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測LC3A、Beclin-1、Bcl-2、Bax的蛋白及m RNA的表達水平;流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況;。結(jié)果:1.與對照組尿氟和骨氟[(1.92±0.12)mg/L、(185.57±13.27)mg/Kg]比較,低、高氟組大鼠尿氟含量分別為[(2.18±0,14)mg/L、(2.40±0.19)mg/L]、骨氟含量[分別為(237.42±18.48)mg/Kg、(248.00±14.72)mg/Kg]均明顯升高(P0.05)。染氟組大鼠肝臟肝細胞索排列稍有紊亂,肝細胞水腫,病理形態(tài)學改變不明顯。與對照組比較,染氟組大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase ALS)活性及谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferaseAST)活性明顯升高,總蛋白(TP)與白蛋白(ALB)活性逐漸下降(P0.05)。免疫組化示:低、高氟組大鼠肝臟組織中LC3A蛋白[(35.35±2.71)、(44.10±6.72)]、Beclin-1蛋白[(57.56±12.1)、(74.76±18.67)]及Bax[(51.1±9.23)、(62.32±10.3)]的表達明顯高于對照組[(27.55±2.33)、(40.34±6.89)(40.00±8.03)],Bcl-2蛋白表達分別為[(55.18±8.36)、(39.05±6.91)]明顯低于對照組(79.71±10.92)(P0.05);低、高氟組大鼠成骨組織中LC3A蛋白[(38.42±3.05)、(50.72±4.73)]、Beclin-1蛋白[(60.64±9.32)、(80.19±11.78)]、Bax蛋白[(51.26±11.05)、(64.93±12.74)]的表達明顯高于對照組[(25.79±2.57)、(38.52±7.23)、(36.94±9.48)],染氟組中Bcl-2蛋白表達分別為[(62.67±9.63)、(47.73±7.43)]明顯低于對照組(83.54±11.43)(P0.05)。WB實驗顯示:低、高氟組大鼠肝臟組織中LC3A蛋白[(1.311±0.123),(1.633±0.100)]、Beclin-1蛋白[(1.278±0.158)、(1.691±0.283)]、Bax蛋白[(0.473±0.075)、(0.678±0.048)]的表達分別高于對照組[(0.961±0.110)、(0.579±0.104)、(0.288±0.021)];低、高氟組Bcl-2蛋白[(0.826±0.117)、(0.599±0.013)]的表達明顯低于對照組(1.188±0.156)(P0.05)。2.培養(yǎng)24h的染氟組(0、2.5、5、10mg/L)細胞增殖率分別為(100%、131.38%、151.82%、115.80%),48h的增殖率分別為(100%、115.87%、83.31%、79.06%),72h的增殖率分別為(100%、80.91%、81.22%、66.66%)。染氟組處理24h后,分別用自噬特異性抑制劑3-MA(濃度2.5、5、10mmol/L)處理24h后,10mmol/L的3-MA對細胞的抑制率為52.1%。Beclin-1、LC3A、Bcl-2、Bax的蛋白及m RNA在對照組、對照+3-MA兩組之間的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。WB實驗顯示:大鼠成骨細胞中低、高氟組大鼠成骨細胞中LC3A蛋白[(1.271±0.254)、(1.680±0.158)]、Beclin-1蛋白[(1.245±0.240)、(1.561±0.443)]、Bax蛋白[(1.252±0.060)、(1.001±0.190)]的表達明顯高于對照組LC3A蛋白(0.726±0.152)、Beclin-1蛋白(0.668±0.122)、Bax蛋白(0.879±0.890);Bcl-2蛋白[(0.616±0.08)、(0.894±0.153)]表達較對照組(1.276±0.670)明顯下降。3-MA處理染氟細胞后,LC3A蛋白[(0.655±0.023)、(1.006±0.100)]、Beclin-1蛋白[(0.789±0.168)、(1.187±0.201)]、Bcl-2蛋白[(0.434±0.047)、(0.581±0.056)]的表達與同濃度染氟組相比明顯下降;而Bax蛋白[(1.546±0.057)、(1.289±0.088)]的表達水平與同濃度染氟組相比升高,以低氟+3-MA組升高最明顯(P0.05)。Real-time PCR實驗結(jié)果示:低、高氟組成骨細胞中LC3Am RNA[(2.381±0.205)、(3.154±0.384)]、Beclin-1 m RNA[(0.978±0.104)、(1.129±0.156)]、Bax m RNA[(2.348±0.254)、(1.508±0.147)]的表達水平較對照組LC3Am RNA(1.562±0.148)、Beclin-1 m RNA(0.697±0.057)、Bax m RNA(1.248±0.136)明顯升高,3-MA處理染氟成骨細胞后LC3A m RNA[(1.473±0.129)、(1.936±0.204)]、Beclin-1 m RNA[(0.508±0.054)、(0.903±0.106)]、Bcl-2 m RNA[(0.202±0.032)、(0.378±0.040)]的表達水平較相同濃度染氟組降低,染氟成骨細胞經(jīng)3-MA處理后Bax m RNA[(3.872±0.367)、(2.408±0.289)]的表達水平較同濃度染氟組升高,以低氟+3-MA組升高最明顯(P0.05)。流式細胞術(shù)檢測示:對照組(16.85%)和對照+3-MA(17.14%)凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),低氟組(25.04%)、高氟組(21.28%)較對照組凋亡率升高(P0.05),3-MA處理染氟成骨細胞后凋亡率增高,低氟+3-MA組(42.05%)增加最明顯,高氟+3-MA組凋亡率(32.51%)增高(P0.05)。結(jié)論:1.過量氟可激活大鼠肝和骨組織中自噬LC3A、Beclin-1及凋亡因子Bcl-2、Bax,自噬和凋亡可能共同參與慢性氟中毒所致肝臟及成骨細胞損傷的發(fā)病過程。2.自噬與凋亡共同參與了氟對成骨細胞損傷的發(fā)生機制。
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本文編號：1470374