發(fā)布時間：2018-01-24 13:26

  本文關(guān)鍵詞： n-3多不飽和脂肪酸 脂類合成 胰島素抵抗 胰島素誘導(dǎo)基因　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：1目的胰島素抵抗(IR)不僅可以誘發(fā)Ⅱ型糖尿病,而且可以誘發(fā)諸多代謝性疾病,嚴(yán)重危害人類健康。目前,對胰島素抵抗進(jìn)行干預(yù)進(jìn)而防治糖尿病的發(fā)展和惡化已經(jīng)成為一個研究熱點,非藥物性干預(yù)是其中的一個重要手段。嚴(yán)重的脂代謝紊亂及胰島素作用靶器官、組織對胰島素敏感性的降低組成了IR的重要病理特征,而脂代謝紊亂又是動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等諸多代謝性疾病的重要危險因素之一。所以,改善脂代謝紊亂已經(jīng)成為干預(yù)、治療IR的一個重要措施。獲得與人類發(fā)病機理相似的IR動物模型是開展相關(guān)研究的關(guān)鍵,高脂飲食作為重要的環(huán)境條件可成功誘發(fā)肥胖型IR動物模型。n-3多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)作為長鏈多不飽和脂肪酸,其命名來源于第一個不飽和雙鍵距離甲基端的碳原子數(shù)目。目前,越來越多的研究關(guān)注n-3PUFA飲食的高脂血癥防控功能,以期獲得科學(xué)數(shù)據(jù),進(jìn)而用以預(yù)防和治療脂代謝紊亂相關(guān)疾病。研究表明,n-3PUFA可以預(yù)防高脂飲食誘發(fā)大鼠胰島素抵抗,但n-3PUFA對胰島素抵抗大鼠的改善及脂代謝調(diào)節(jié)作用的機理尚不明確。n-3PUFA包括α-亞麻酸(ALA,C18:3)、二十碳五烯酸(EPA,C20:5)和二十二碳六烯酸(DHA,C22:6),相對于DHA和EPA而言,ALA的相關(guān)研究較少。本研究利用血生化分析、比色法、氣相色譜、超速離心等分析技術(shù),冷凍切片、常規(guī)病理染色等病理形態(tài)學(xué)分析實驗技術(shù),real-time q PCR以及Western blot等分子生物學(xué)技術(shù),分析在n-3PUFA干預(yù)后,IR動物與細(xì)胞模型脂類合成關(guān)鍵基因表達(dá)水平的變化,為ALA在IR脂代謝紊亂的改善及治療中的進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。2內(nèi)容本實驗通過給予胰島素抵抗大鼠富含蘇子油的高脂日糧,分析在保持日糧總能量不變的情況下,蘇子油高脂飲食干預(yù)對IR大鼠血脂生化指標(biāo),肝臟及血清ALA含量,肝臟膽固醇(TCH)、甘油三酯(TG)合成關(guān)鍵基因m RNA、蛋白表達(dá)水平及肝臟脂肪沉積的影響,并首次探究其是否通過調(diào)控胰島素誘導(dǎo)基因-1(INSIG-1)/胰島素誘導(dǎo)基因-2(INSIG-2)的mRNA、蛋白表達(dá)來影響脂類的合成;在動物實驗基礎(chǔ)上進(jìn)一步從細(xì)胞水平分析,同樣替代比例的ALA對軟脂酸處理后的胰島素抵抗Hep G2(IR-Hep G2)細(xì)胞模型上述基因m RNA、蛋白表達(dá)的影響,綜合分析體內(nèi)與體外實驗結(jié)果,探討ALA對IR脂代謝紊亂的影響及可能機制。3方法將48只SPF級雄性SD大鼠隨機分為2組進(jìn)行胰島素抵抗造模:對照組(NC)12只、高脂組(HF)36只。當(dāng)HF組大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗后,將出現(xiàn)胰島素抵抗的24只HF組大鼠隨機分為2組:HF、蘇子油組(PO),每組12只。干預(yù)4周后,氣相色譜法檢測大鼠血清及肝臟ALA含量,酶法檢測血清及肝臟TCH、TG水平,real time q PCR檢測TG、TCH合成關(guān)鍵基因m RNA水平,Western blot檢測TG、TCH合成關(guān)鍵基因蛋白表達(dá)量。Hep G2細(xì)胞造模期同樣分為兩組,由無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的對照組(NC)以及用來誘發(fā)IR-Hep G2細(xì)胞模型的含有0.25mmol/L軟脂酸的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的軟質(zhì)酸組(PA),培養(yǎng)24h后測定細(xì)胞內(nèi)TCH、TG水平,并用無酚紅低糖培養(yǎng)基鑒定胰島素抵抗細(xì)胞模型,模型成立后用20%ALA替代軟脂酸培養(yǎng)12h,再次檢測細(xì)胞內(nèi)TCH、TG水平,real time q PCR檢測TG、TCH合成關(guān)鍵基因m RNA水平,Western blot檢測TG、TCH合成關(guān)鍵基因蛋白表達(dá)量。4結(jié)果4.1大鼠(1)分析造模期采食量可以得知,HF組大鼠能量攝入及脂肪形式能量攝入均顯著高于NC組(P0.0001);血清生化指標(biāo)結(jié)果顯示,HF組大鼠血清TG水平顯著高于NC組(P0.05),而兩組大鼠血清TCH水平并沒有統(tǒng)計學(xué)差異;高胰島素-正常血糖鉗夾實驗結(jié)果顯示,HF組大鼠葡萄糖灌注率(GIR)顯著低于NC組(P=0.0086),HF組大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗,說明造模成功;(2)蘇子油高脂飲食干預(yù)4周后,隨著PO組大鼠ALA攝入量顯著高于HF組(P0.0001),PO組大鼠血清、肝臟內(nèi)ALA含量均顯著升高(P=0.0006),伴隨著大鼠血清及肝臟TG含量的顯著降低(P0.05),肝臟病理切片結(jié)果顯示脂肪沉積得到明顯改善,而兩組大鼠血清與肝臟TCH水平及胰島素敏感性并沒有體現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異;(3)實時定量PCR結(jié)果顯示,與HF組相比,PO組INSIG-2基因m RNA相對表達(dá)量顯著升高(P=0.005),SREBP-2基因m RNA相對表達(dá)量顯著降低(P=0.042);而INSIG-1、SREBP-1、FASN、HMGCR基因m RNA相對表達(dá)量與HF組相比無統(tǒng)計學(xué)差異;(4)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,與HF組相比,PO干預(yù)后IR大鼠肝臟INSIG-2表達(dá)量顯著升高,FASN、HMGCR表達(dá)量顯著降低,而兩組INSIG-1表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異;與HF組相比,PO組125k Da SREBP-1c表達(dá)無明顯變化,65k Da SREBP-1c表達(dá)及65k Da/125k Da SREBP-1c比值均顯著降低,而126k Da SREBP-2表達(dá)、55k Da SREBP-2表達(dá)、55k Da/126k Da SREBP-2比值均顯著降低。4.2 Hep G2細(xì)胞(1)0.25mmol/LPA培養(yǎng)細(xì)胞24h后,雖然細(xì)胞活性有所下降,而PA組Hep G2細(xì)胞葡萄糖攝取量顯著低于NC組(P=0.0007),說明IR-Hep G2細(xì)胞模型建立成功,進(jìn)一步檢測細(xì)胞內(nèi)脂類水平發(fā)現(xiàn),PA組TG、TCH水平均有不同程度的升高,但只有TCH水平顯著高于NC組(P=0.0016),出現(xiàn)了脂代謝紊亂;(2)ALA干預(yù)IR-Hep G2細(xì)胞12h后,細(xì)胞活性有所恢復(fù),與PA組相比,ALA組INSIG-1/2基因及脂類合成關(guān)鍵蛋白的基因m RNA表達(dá)無明顯影響,但是對SREBP-2基因m RNA表達(dá)的抑制率為32%;(3)與大鼠體內(nèi)結(jié)果相同的是,ALA干預(yù)后可以特異性的提升細(xì)胞內(nèi)INSIG-2蛋白相對表達(dá)量,且對INSIG-1蛋白相對表達(dá)量沒有明顯變化。ALA組與TG合成相關(guān)的65k Da SREBP-1c蛋白表達(dá)有所降低,但沒有差異,而ALA組FASN蛋白表達(dá)量降低了21%。同時,ALA可以顯著抑制55k Da SREBP-2、HMGCR蛋白的表達(dá),抑制率分別為43%、79%,TCH合成明顯受抑制。與體內(nèi)實驗相同的是,與PA組相比,ALA組只有細(xì)胞內(nèi)TG水平顯著降低(P=0.0119),而細(xì)胞內(nèi)TCH水平無統(tǒng)計學(xué)差異。5結(jié)論5.1大鼠(1)在持續(xù)高脂飲食的情況下,給予IR大鼠補充0.556g/d ALA,可通過提升INSIG-2蛋白表達(dá),抑制SREBP-1c從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的移位剪切活化,進(jìn)而降低65k Da SREBP-1c水平及下游靶基因FASN的表達(dá)、肝細(xì)胞內(nèi)TG的合成,從而降低細(xì)胞內(nèi)TG水平及改善IR大鼠脂質(zhì)代謝紊亂;(2)蘇子油高脂飲食雖然通過提升INSIG-2表達(dá)抑制了TCH合成關(guān)鍵酶SREBP-2及其下游靶基因HMGCR的表達(dá),但是并沒有降低血清及肝臟TCH含量;(3)蘇子油高脂飲食可以特異性促進(jìn)IR大鼠肝臟INSIG-2基因m RNA、蛋白表達(dá),對INSIG-1基因m RNA、蛋白表達(dá)無明顯影響。5.2 Hep G2細(xì)胞(1)0.25mmol/LPA培養(yǎng)細(xì)胞24h可以誘發(fā)Hep G2細(xì)胞胰島素抵抗,并且伴有細(xì)胞脂代謝異常和細(xì)胞活性的降低;(2)0.05mmol/LALA可以改善IR-Hep G2細(xì)胞中脂代謝紊亂,但對其胰島素敏感性無顯著影響,且與體內(nèi)結(jié)果一樣,ALA只顯著降低細(xì)胞內(nèi)TG水平,而對細(xì)胞內(nèi)TCH沒有明顯影響;(3)與體內(nèi)結(jié)果一致的是,ALA特異性促進(jìn)IR大鼠肝臟INSIG-2蛋白表達(dá),對INSIG-1基因m RNA、蛋白表達(dá)無明顯影響;(4)ALA干預(yù)IR-Hep G2細(xì)胞后,通過INSIG-2蛋白表達(dá)的顯著升高,進(jìn)而抑制SREBP-2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的剪切成熟活化,降低細(xì)胞內(nèi)55k Da SREBP-2水平及下游靶基因HMGCR的表達(dá),并且抑制FASN表達(dá),從而抑制了TG/TCH的合成。
[Abstract]:1 insulin resistance (IR) can not only induce type II diabetes, and can induce many metabolic diseases, serious harm to human health. At present, the development and progression of intervention on insulin resistance and diabetes has become a hot topic of research, non drug intervention is one of the important means. Serious lipid metabolism disorder and insulin target organs, reduce the tissue sensitivity to insulin have important pathological characteristics in IR, and lipid metabolism disorder and atherosclerosis, hypertension, one of the important risk factors of coronary heart disease and other metabolic diseases. Therefore, improving lipid metabolism has become an important measure of intervention for the treatment of IR. IR animal the model is similar to the pathogenesis of human is the key to carry out related research, high fat diet as an important environmental conditions can be successfully induced obese IR animal model Type.N-3 polyunsaturated fatty acid (n-3PUFA) as long-chain polyunsaturated fatty acids, the number one unsaturated double bond distance methyl end carbon atoms of the origin of its name. At present, hyperlipidemia prevention function more and more research on the n-3PUFA diet, in order to obtain scientific data, and then to prevent and treatment of lipid metabolism related diseases. The results show that n-3PUFA can prevent insulin resistance in rats induced by high fat diet, but the mechanism of n-3PUFA on the improvement of insulin resistance and lipid metabolism in rats of the regulation is not clear.N-3PUFA including alpha linolenic acid (ALA, C18:3), twenty carbon (EPA, C20:5) five AA and twenty-two six carbon acid (DHA, C22:6), compared with DHA and EPA, ALA related research less. This study by blood biochemical analysis, colorimetric method, gas chromatography and ultracentrifugation analysis techniques, frozen sections, routine pathological staining pathological morphology Analysis of experimental technology, real-time Q PCR and Western blot and other molecular biology techniques, analysis of the intervention in n-3PUFA, changes in the level of IR and animal cell model of lipid synthesis key gene expression, to provide scientific data for.2 content given high fat diet rats with insulin resistance in Perilla seed oil by this experiment for the further application of ALA in improving and treatment IR lipid metabolic disorder in the analysis of total energy diets keep unchanged, perilla oil and high fat diet intervention on blood lipid of IR rats and the liver biochemical indexes, the content of ALA in serum, liver cholesterol (TCH), triglyceride (TG) synthesis of key genes M RNA, protein expression level and hepatic fat deposition for the first time, and to explore whether through the regulation of insulin induced gene -1 (INSIG-1) / insulin induced gene -2 (INSIG-2) mRNA and protein expression to affect lipid synthesis; based on animal experiments. 涓，

本文編號：1460149