發(fā)布時(shí)間：2018-01-19 02:01

  本文關(guān)鍵詞： arrestin 基因敲除小鼠 縮膽囊素 胰島　出處：《山東大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：Arrestins是一組具有重要作用的蛋白。它可調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Arrestin同G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合使G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路被阻斷,且介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)吞；Arrestin還啟動(dòng)新的非G蛋白依賴的信號(hào)途徑,例如ERK和Src等信號(hào)途徑。除了結(jié)合GPCR, arrestin可以同許多細(xì)胞表面受體家族及多種信號(hào)途徑蛋白結(jié)合。哺乳動(dòng)物表達(dá)arrestin的四種亞型,其中P-arrestin-1和P-arrestin-2的表達(dá)在哺乳動(dòng)物中十分廣泛,并且具有十分重要的功能。為了研究β-arrestin-1和β-arrestin-2的生理功能,β-arrestin-1和β-arrestin-2兩種基因敲除小鼠被廣泛應(yīng)用。目前,應(yīng)用β-arrestin-1和β-arrestin-2的基因敲除小鼠,研究許多生理問題：G蛋白偶聯(lián)受體受到相關(guān)激素或配體刺激后,下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控；各系統(tǒng)器官的發(fā)育及功能的維持；各種疾病及外界環(huán)境刺激所致疾病的轉(zhuǎn)歸等。其中較多的研究結(jié)果來自于β-arrestin-2基因敲除小鼠,而對(duì)β-arrestin-1基因敲除小鼠的研究較少。本實(shí)驗(yàn)室的前期胰島p細(xì)胞系MIN6細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,β-arrestin-1在硫化縮膽囊素八肽(CCK-8s)抗p細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用；為了研究CCK-8s對(duì)原代胰島p細(xì)胞的作用,我們通過β-arrestin-1的敲除小鼠的胰島和胰島p細(xì)胞,證實(shí)了β-arrestin-1在CCK-8s結(jié)合CCK1受體進(jìn)而促進(jìn)胰島素分泌及抗胰島p細(xì)胞凋亡中的作用。研究胰島p細(xì)胞中CCK1受體激活后不同下游通路的偏向性,對(duì)開發(fā)新的抗糖尿病藥物奠定了基礎(chǔ)。[研究目的]運(yùn)用β-arrestin-1敲除小鼠,研究CCK-8s對(duì)胰島p細(xì)胞凋亡和胰島素分泌的作用及機(jī)制。[研究方法]1.實(shí)驗(yàn)用基因敲除小鼠及野生型小鼠的準(zhǔn)備(1) 純合敲基因小鼠同C57小鼠的回交。(2) F1代雜合小鼠的選育及配種。(3) 逆轉(zhuǎn)錄PCR區(qū)分野生型及非野生型F2代小鼠。(4) 實(shí)時(shí)定量PCR區(qū)分F2代雜合及純合小鼠。(5) 以上述方法擴(kuò)大種群數(shù)量,選取同窩野生及純合基因敲除小鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1) 使用ELISA試劑盒檢鋇β-arrestin-1敲除小鼠和野生C57小鼠胰島給予CCK-8s后胰島素分泌的變化。(2) 使用ELISA試劑盒檢測(cè)β-arrestin-1敲除小鼠和野生C57小鼠胰島給予CCK-8s后IP3, cAMP的變化。(3) P-arrestin-1敲除小鼠和野生C57小鼠STZ糖尿病造模,期間給予CCK-8s,驗(yàn)證β-arrestin-1同CCK-8s保護(hù)作用是否相關(guān)。(4) 用蛋白印記分析技術(shù)(Western blot)檢測(cè)β-arrestin-1敲除小鼠和野生C57小鼠胰島抗凋亡途徑。[研究結(jié)果]P-arrestin-1基因敲除小鼠的胰島同野生型小鼠胰島相比,在受到CCK-8s刺激后,分泌胰島素的量減少。P-arrestin-1基因敲除小鼠的胰島同野生型小鼠胰島相比,CCK-8s通過激活CCKI受體引起cAMP的累積效應(yīng)下降。CCK-8能改善STZ糖尿病造模的C57野生型小鼠的葡萄糖耐量,但不能改善β-arrestin-1敲除小鼠經(jīng)STZ糖尿病造模后的糖耐量。Western blot顯示,β-arrestin-1基因敲除小鼠的胰島同野生型小鼠胰島相比,CCK-8s引起p90RSK-phosphor-Bad信號(hào)通路的激活被明顯抑制。[結(jié)論]β-arrestin-1在CCK-8s通過CCK1受體所引起的胰島p細(xì)胞胰島素的分泌和對(duì)p細(xì)胞抗凋亡過程中具有十分重要的作用。
[Abstract]:Arrestins is a group which plays an important role in the signaling pathway downstream signal transduction proteins..Arrestin it can regulate G protein coupled receptor and G protein coupled receptor binding to the G protein mediated endocytosis is blocked, and mediated by G protein coupled receptor; Arrestin signaling pathway also launched new non G dependent protein. For example, ERK and Src signaling pathway. In addition with GPCR, arrestin can be combined with a protein surface multicellular receptor family and multiple signaling pathways. Mammalian expression of four subtypes of arrestin, P-arrestin-1 and P-arrestin-2 expression in mammals is very extensive, and has very important function. In order to study the physiological functions of -arrestin-1 and beta -arrestin-2 beta, beta -arrestin-1 and beta -arrestin-2 two gene knockout mice are widely used. At present, the application of beta -arrestin-1 and beta -arrestin-2 gene knockout mice, research Many physical problems: G protein coupled receptors are related to hormone or ligand stimulation, signal transduction and regulation of downstream; maintain the development and function of organs and systems; a variety of diseases and prognosis of diseases caused by external environmental stimuli. Many research results from the beta -arrestin-2 gene knockout mice, while the beta -arrestin-1 gene knockout mice are seldom studied. That the pancreatic P cell line MIN6 cells in our laboratory, beta -arrestin-1 in curing cholecystokinin eight peptide (CCK-8s) plays an important role in anti apoptosis of P cells; in order to study the effects of CCK-8s on cultured islet P cells, we through beta -arrestin-1 knockout mice islet and islet P cells, confirmed the beta -arrestin-1 in CCK-8s binding CCK1 receptor and promote the secretion and anti apoptosis of P cells in insulin action. CCK1 study of pancreatic islet P cell receptor kinase The bias of different downstream pathways of the work, laid the foundation for research purposes. The use of beta -arrestin-1 knockout mice to develop new anti diabetic drugs, gene knockout mice and wild-type mice. Methods to study the effects and mechanisms of CCK-8s on apoptosis and insulin secretion of islet P cells in the]1. experiment (1) pure combined knock-out mice with C57 mouse backcross. (2) F1 heterozygous mice breeding and breeding. (3) reverse transcriptase PCR distinguish between wild-type and non wild type F2 mice. (4) real time quantitative PCR to distinguish F2 generation heterozygous and homozygous mice. (5) the above method to expand the population the number of selected littermate wild and homozygous knockout mice by animal experiment animal experiment of.2. (1) ELISA kit for detecting beta -arrestin-1 knockout mice islet insulin secretion changes of mice and wild C57 after administration of CCK-8s. (2) using the ELISA kit for detection of beta -arrestin-1 Knockout mice and wild mice islet C57 after administration of CCK-8s IP3, cAMP. (3) P-arrestin-1 knockout mice in diabetic STZ mice and wild C57 model, given during CCK-8s, verify the protective effect of CCK-8s beta -arrestin-1 with correlation. (4) by Western blot analysis technology (Western blot) to detect beta -arrestin-1 knockout mice and wild mice islet C57 anti apoptosis pathway. The results of]P-arrestin-1 gene knockout mice with pancreatic islet compared to wild-type mice, under CCK-8s stimulation of insulin secretion decreased in.P-arrestin-1 knockout mice and wild-type mice compared to pancreatic islet, the cumulative effect of CCK-8s through activation of CCKI receptor causes a decrease in the cAMP C57 wild type mice.CCK-8 STZ diabetes model can improve the glucose tolerance, but cannot improve beta -arrestin-1 knockout mice by STZ diabetic rats after glucose tolerance.Western bl Ot showed that the beta -arrestin-1 gene knockout mice and wild-type mice compared to pancreatic islet, the activation of the p90RSK-phosphor-Bad signaling pathway was inhibited. Conclusion] beta -arrestin-1 in CCK-8s through plays an important role on P secretion and cell apoptosis of CCK1 induced by insulin receptor of islet P cells induced by CCK-8s.

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.1

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本文編號(hào)：1442115