本文關鍵詞：TAK1信號通路在高糖誘導骨髓來源巨噬細胞激活中的作用　出處：《安徽醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 轉化生長因子β激活激酶1 巨噬細胞活化 高糖 炎癥

【摘要】：背景與目的患糖尿病人數(shù)逐年增加,糖尿病腎病(DN)的發(fā)病率也隨之升高。目前普遍認為糖尿病腎病是一種慢性低度炎癥性疾病,巨噬細胞在DN發(fā)生發(fā)展中起重要作用,而靜止的巨噬細胞對腎臟無損傷作用,只有活化的巨噬細胞才能發(fā)揮促炎性損傷及促纖維化作用。然而巨噬細胞活化的分子機制目前尚不清楚。轉化生長因子β激活激酶1(TGF-βactivated kinase-1,TAK1)屬于絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen activated protein kinase kinase kinase,MAP3K)家族成員,是MAPKs和核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路共同上游信號分子,能介導多條炎癥通路激活,發(fā)揮促炎效應。然而在高糖條件下TAK1信號通路是否介導骨髓來源巨噬細胞(bone marrow derived macrophages,BMDM)活化尚未見報道。本研究通過觀察高濃度葡萄糖刺激及不同濃度TAK1特異性抑制劑5Z-7-oxozeaenol作用下,細胞上清液中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、單核細胞趨化因子(MCP)-1分泌情況及磷酸化(p)-TAK1、TAK1結合蛋白(TAK1binding protein,TAB1)、p-JNK、NF-κB p65蛋白表達變化,探討高糖刺激巨噬細胞活化及炎癥因子分泌增加是否由TAK1信號通路部分介導。方法1.小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMDM)的分離、培養(yǎng)。2.應用流式細胞術鑒定BMDM純度。3.采用CCK-8法檢測不同濃度5Z-7-oxozeaenol(10-1000nmol/L)的細胞毒性。4.應用Transwell小室構建巨噬細胞和系膜細胞共培養(yǎng)模型。5.實驗分組:按培養(yǎng)方式分為巨噬細胞和系膜細胞共培養(yǎng)、巨噬細胞單培養(yǎng)2種,每種培養(yǎng)方式按培養(yǎng)條件分7組:(1)抑制劑對照組(OZ300);(2)滲透壓對照組(mannitol control,MC);(3)正常對照組(normal control,NC);(4)高糖組(high glucose,HG);(5)高糖+30n M抑制劑組(HG+OZ30);(6)高糖+100n M抑制劑組(HG+OZ100);(7)高糖+300n M抑制劑組(HG+OZ300)。6.采用免疫熒光雙染法檢測M1巨噬細胞表型標志誘導型一氧化氮合酶(i NOS)的表達。7.采用ELISA法檢測單培養(yǎng)和共培養(yǎng)模型中各組細胞上清液TNF-α、IL-1β、MCP-1含量變化。8.應用Western印跡技術檢測高糖刺激不同時間點單培養(yǎng)巨噬細胞p-TAK1、TAB1、p-JNK、NF-κB p65蛋白表達變化及不同濃度5Z-7-oxozeaenol抑制作用。9.通過激光共聚焦技術檢測TAK1抑制劑對高糖刺激巨噬細胞NF-κB p65核轉移的影響。結果1.經流式細胞術檢測BMDM純度達99.36%。2.本實驗觀察范圍內5Z-7-oxozeaenol濃度(30-300nmol/L)對高糖誘導的BMDM活性均無影響(P均㧐0.05),給予1000nmol/L的5Z-7-oxozeaenol干預可使BMDM活性降低(P㩳0.05)。3.高糖組巨噬細胞表型標志i NOS熒光強度明顯高于對照組,抑制劑干預組i NOS熒光強度較高糖組明顯減弱。4.高糖刺激下,單培養(yǎng)和共培養(yǎng)細胞上清液中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量均較對照組升高(P均0.05),巨噬細胞與系膜細胞共培養(yǎng)模型組上清液中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量較BMDM單培養(yǎng)組升高(P0.05)。與高糖組比較,TAK1抑制劑呈濃度依賴性降低各組上清液中炎癥因子含量(P0.05)。5.在BMDM單培養(yǎng)條件下,與對照組比較,高糖刺激巨噬細胞p-TAK1、TAB1、p-JNK、NF-κB p65蛋白表達水平均上調(P均0.05),抑制劑組5Z-7-oxozeaenol呈濃度依賴性降低巨噬細胞p-TAK1、TAB1、p-JNK、NF-κB p65蛋白表達量(P0.05)。6.通過激光共聚焦顯微鏡觀察到高糖刺激能誘導BMDM胞漿中NF-κB p65亞基入核,300nmol/L的5Z-7-oxozeaenol干預可明顯抑制NF-κB p65核轉移。結論1.高糖刺激可上調i NOS表達,誘導骨髓來源巨噬細胞(BMDM)向M1型巨噬細胞活化。2.TAK1可能通過激活下游JNK和NF-κB信號通路,從而促進巨噬細胞向促炎表型極化。3.高糖刺激可誘導BMDM分泌TNF-α、IL-1β和MCP-1,而巨噬細胞與系膜細胞共培養(yǎng)能進一步促進這些炎癥因子的分泌,加重炎癥反應。4.TAK1特異性抑制劑5Z-7-oxozeaenol能抑制TAK1/JNK和TAK1/NF-κB通路激活,降低高糖條件下M1型巨噬細胞活化,并減少炎癥因子TNF-α、IL-1β和趨化因子MCP-1的產生,從而減輕炎癥反應。
[Abstract]:Background and objective: diabetes has increased the number of diabetic nephropathy (DN), the incidence rate is also increased. It is generally believed that the diabetic nephropathy is a chronic inflammation disease, macrophages play an important role in the pathogenesis of DN, but still no damage to kidney macrophages, activated macrophages can only exert pro-inflammatory damage and profibrotic effect. However, the molecular mechanism of macrophage activation is unclear. Transforming growth factor activated kinase 1 (TGF- beta activated kinase-1, TAK1) belong to the mitogen activated protein kinase (mitogen activated protein kinase kinase kinase, MAP3K) family members, MAPKs and nuclear factor kappa B (nuclear factor-kappa B NF-, K B) pathways upstream signal molecule mediated by multiple inflammatory pathways activation play a proinflammatory effect. However, in high glucose conditions TAK1 signaling pathway Is mediated by bone marrow macrophages (bone marrow derived macrophages, BMDM) activation has not been reported. This study through the observation of high glucose stimulation and the effects of different concentrations of TAK1 specific inhibitor 5Z-7-oxozeaenol and tumor necrosis factor in the supernatant (TNF) - alpha, interleukin (IL) -1 beta, monocyte chemotactic factor (MCP) -1 secretion and phosphorylation of -TAK1 (P), TAK1 binding protein (TAK1binding, p-JNK, protein, TAB1) expression of NF- kappa B p65 protein, on glucose stimulated macrophage activation and inflammatory cytokines secretion is mediated in part by TAK1 signaling pathway. Methods 1. mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM) separation.2. training, flow cytometry was used to identify BMDM purity of.3. with different concentration of 5Z-7-oxozeaenol was detected by CCK-8 (10-1000nmol/L) on the cytotoxicity of.4. application of Transwell small chamber construction and mesangial cells were macrophages Training model of.5. experimental groups: according to the training mode is divided into co cultured macrophages and macrophages cultured mesangial cells, single 2 kinds, each kind of culture by way of culture conditions were divided into 7 groups: control group (1) inhibitor (OZ300); (2) osmotic pressure control group (mannitol control, MC); (3) normal the control group (normal, control, NC); (4) high glucose group (high glucose, HG); (5) high glucose +30n M inhibitor group (HG+OZ30); (6) high glucose +100n M inhibitor group (HG+OZ100); (7) high glucose +300n M inhibitor group (HG+OZ300) immunofluorescence double staining of M1 macrophages phenotype of inducible nitric oxide synthase by.6. (I NOS) on the expression of.7. was detected by ELISA single and co cultured supernatant of cells in each group of TNF- alpha, IL-1 beta model, the change of the content of MCP-1.8. using Western blot of high glucose at different time points of single cultured macrophage p-TAK1, TAB1, p-JNK, and expression of NF- K B p65 protein Effects of different concentrations of 5Z-7-oxozeaenol inhibited.9. by confocal laser technology to detect TAK1 inhibitors on glucose stimulated macrophage NF- kappa B p65 nuclear transfer. Results 1. the purity of BMDM cells was detected by flow cytometry as 99.36%.2. we observed the concentration range of 5Z-7-oxozeaenol (30-300nmol/L) had no effect on high glucose induced BMDM activity (P? 0.05) 5Z-7-oxozeaenol, give intervention 1000nmol/L can make the activity of BMDM decreased (P? 0.05).3. high glucose group macrophage phenotype marker I NOS fluorescence intensity was significantly higher than the control group, I inhibitor group, NOS fluorescence intensity high sugar group significantly reduced.4. stimulated by high glucose, single and co cultured in the supernatant of TNF- alpha, IL-1 beta, MCP-1 the content were higher than those in control group (P 0.05), TNF- alpha, model group was co cultured with macrophages and mesangial cells of IL-1 beta, MCP-1 content is BMDM single culture group (P0.05) and high rise. Sugar group, TAK1 inhibitor showed a concentration dependent decrease inflammatory cytokine content in supernatant were measured by.5. BMDM (P0.05) in single culture conditions, compared with the control group, high glucose stimulated p-TAK1, TAB1, p-JNK, expression of NF- kappa B p65 protein levels were up-regulated (P 0.05), 5Z-7-oxozeaenol inhibitor group in a concentration dependent manner. Reduce TAB1, macrophage p-TAK1, p-JNK expression of NF- kappa B protein p65 (P0.05).6. by laser confocal microscopy to high glucose induced BMDM cytoplasmic NF- kappa B subunit p65 in the nucleus, 300nmol/L 5Z-7-oxozeaenol intervention can significantly inhibit the NF- kappa B p65 nuclear translocation. Conclusion high glucose stimulated expression of 1. upregulation of I NOS induced bone marrow-derived macrophages (BMDM) activation to M1 macrophages.2.TAK1 may activate downstream JNK and NF- B signaling pathway, which promotes macrophage to proinflammatory phenotype polarization.3. high glucose can induce the secretion of BMDM TNF- alpha, IL-1 beta and MCP-1, and mesangial cells were co cultured with macrophages can further promote the secretion of these cytokines, aggravate the inflammatory response of.4.TAK1 specific inhibitor 5Z-7-oxozeaenol can inhibit TAK1/JNK and TAK1/NF- K B activation, reduce the activation of M1 macrophages under high glucose condition, and reduce the inflammatory factor TNF- alpha, IL-1 beta and chemotaxis factor MCP-1, in order to reduce inflammation.

【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1

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