本文關(guān)鍵詞：人EPCs來(lái)源外泌體修復(fù)糖尿病大鼠皮膚缺損的作用及機(jī)制　出處：《南昌大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景和目的:皮膚創(chuàng)面難愈是糖尿病最常見和致殘率高的慢性并發(fā)癥之一。血管新生是傷口愈合過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟,它可為損傷區(qū)帶來(lái)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),以促進(jìn)創(chuàng)面細(xì)胞增殖、再上皮化和膠原再生。然而,糖尿病患者的血管新生能力常常降低,以致傷口遷延不愈。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是成熟內(nèi)皮細(xì)胞的天然祖細(xì)胞,研究證實(shí)EPCs移植可促進(jìn)糖尿病動(dòng)物皮膚缺損處血管新生和傷口閉合。新近研究發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞主要通過(guò)旁分泌機(jī)制發(fā)揮其治療功能,而外泌體是其中一種重要的旁分泌因子,可獨(dú)立地作為一種生物活性成分應(yīng)用于組織再生。目前較少有關(guān)于外泌體修復(fù)糖尿病難愈創(chuàng)面的研究報(bào)道。鑒于EPCs強(qiáng)大的促血管新生和皮膚損傷修復(fù)功能,我們推測(cè)EPCs分泌的外泌體(EPCs derived exosomes,EPC-Exos)很可能具有促進(jìn)皮膚缺損處血管新生和創(chuàng)傷愈合的功能。為此,我們探究了EPC-Exos對(duì)糖尿病大鼠皮膚損傷的修復(fù)功能和作用機(jī)制,以期為糖尿病難愈創(chuàng)面的治療提供一條新策略。方法:1.人臍血來(lái)源EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定1.1 EPCs的分離培養(yǎng):采用經(jīng)典的密度梯度離心法分離人臍血中的單個(gè)核細(xì)胞,并采用EGM-2MV完全培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)出EPCs。1.2 EPCs的鑒定:普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài);免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)鑒定EPCs表面標(biāo)志;體外檢測(cè)EPCs在Matrigel表面成血管的能力;通過(guò)熒光染色檢測(cè)EPCs攝取Di L-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1的能力。2.EPC-Exos的收集與鑒定2.1 EPC-Exos的收集:采用經(jīng)典的超速離心法結(jié)合超濾法從EPCs的條件培養(yǎng)基中提取其分泌的外泌體即EPC-Exos。2.2 EPC-Exos的鑒定:透射電子顯微鏡下觀察EPC-Exos的形態(tài);可調(diào)電阻脈沖感應(yīng)技術(shù)(tunable resistive pulse sensing,TRPS)分析EPC-Exos的直徑和濃度;Western技術(shù)檢測(cè)EPC-Exos的表面標(biāo)志物。3.EPC-Exos對(duì)糖尿病大鼠皮膚損傷的修復(fù)作用3.1建立糖尿病大鼠皮膚損傷模型,局部多點(diǎn)注射不同濃度的EPC-Exos(2×1010或1×1011 particles,200μL PBS溶解)或等體積的PBS。3.2于移植后第4、7和14天觀察創(chuàng)面愈合情況并計(jì)算傷口閉合率。3.3于移植后第14天行HE染色觀察創(chuàng)面上皮化和疤痕形成情況,比較各組上皮化百分率和疤痕寬度;Masson染色觀察創(chuàng)面膠原再生情況。4.EPC-Exos對(duì)糖尿病大鼠皮膚損傷處血管新生的影響4.1于移植后第14天切取各組創(chuàng)面并將內(nèi)面翻轉(zhuǎn)朝上,觀察創(chuàng)面血管形成情況。4.2利用Micro-CT聯(lián)合Microfil灌注技術(shù)觀察創(chuàng)面血管形成情況。4.3采用CD31和α-SMA免疫熒光染色觀察創(chuàng)面血管新生和成熟情況。5.EPC-Exos調(diào)控血管新生的機(jī)制5.1將Di O綠色熒光探針標(biāo)記的EPC-Exos與人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human microvascular endothelial cells,HMECs)共培養(yǎng),在熒光顯微鏡下觀察HMECs對(duì)EPC-Exos的攝取情況。5.2通過(guò)CCK8增殖實(shí)驗(yàn)、Matrigel表面成管實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)不同濃度EPC-Exos對(duì)HMECs增殖、成管和遷移能力的影響。5.3通過(guò)基因表達(dá)譜芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析檢測(cè)EPC-Exos作用后HMECs中差異表達(dá)的基因和主要影響的信號(hào)通路。5.4通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)和western明確EPC-Exos對(duì)Erk1/2信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。5.5將Erk1/2信號(hào)通路的選擇性抑制劑U0126作用于HMECs,觀察EPC-Exos對(duì)HMECs基因和蛋白的表達(dá)、增殖、成管和遷移功能的調(diào)控作用是否消失。結(jié)果:1.成功從人臍血中分離培養(yǎng)出EPCs:EPCs克隆一般在培養(yǎng)后7-10天出現(xiàn),呈典型血管內(nèi)皮樣形態(tài)、“鋪路石”狀排列;免疫熒光和流式結(jié)果顯示,EPCs高表達(dá)CD31、CD34、CD133、v WF、VEGFR-2和VE-cadherin,不表達(dá)CD45;功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EPCs具有在Matrigel表面成管、攝取Di L-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1的能力。2.成功從EPCs的條件培養(yǎng)基中收集到EPC-Exos:EPC-Exos在電鏡下呈形態(tài)基本一致的圓形或橢圓形;TRPS分析結(jié)果顯示EPC-Exos的直徑主要集中在50-60nm;Western結(jié)果顯示EPC-Exos表達(dá)經(jīng)典外泌體表面標(biāo)志CD63、CD81和CD9分子,并表達(dá)內(nèi)皮譜系標(biāo)志物CD31。3.EPC-Exos可促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚傷口的愈合3.1在術(shù)后第4、7、14天,EPC-Exos移植組皮膚傷口的閉合速度比對(duì)照組加快,且隨著EPC-Exos濃度的升高,其促皮膚傷口愈合的作用明顯增強(qiáng)。3.2 HE染色和Masson染色結(jié)果顯示,在術(shù)后第14天,EPC-Exos移植組皮膚傷口上皮化和膠原形成的程度高于對(duì)照組,而疤痕形成減低,且高濃度EPC-Exos的促上皮化、膠原再生和抑制疤痕形成的作用更明顯。4.EPC-Exos可促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚傷口處血管新生4.1在術(shù)后第14天,對(duì)照組大鼠皮膚傷口處血管稀少,而EPC-Exos移植組皮膚傷口處血管數(shù)目明顯增多,且EPC-Exos濃度增大后,血管增多更明顯。4.2基于Micro-CT的血管造影結(jié)果顯示,EPC-Exos移植后可顯著增加大鼠皮膚傷口處新生血管的數(shù)目,且高濃度EPC-Exos促血管生成作用更為顯著。4.3免疫熒光染色顯示,EPC-Exos移植組皮膚創(chuàng)面的CD31陽(yáng)性和CD31/α-SMA雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)明顯增多,且高濃度EPC-Exos移植組皮膚傷口處陽(yáng)性細(xì)胞增多更為顯著,表明EPC-Exos可促進(jìn)皮膚損傷區(qū)的血管新生和成熟。5.EPC-Exos通過(guò)激活Erk1/2信號(hào)通路增強(qiáng)HMECs的成血管功能5.1 Di O標(biāo)記的EPC-Exos可被HMECs攝取,且多聚集在HMECs的細(xì)胞核周圍。5.2 EPC-Exos可增強(qiáng)HMECs的增殖、遷移和成管能力,且高濃度EPC-Exos對(duì)其功能的促進(jìn)作用更明顯。5.3芯片數(shù)據(jù)顯示,EPC-Exos作用后一系列與Erk1/2信號(hào)通路相關(guān)的成血管基因(FGF2、IL-6、IL-8、c-Myc、Id1、Cox-2、VEGFA和CCND1)顯著上調(diào)。5.4 q RT-PCR和western結(jié)果證實(shí),EPC-Exos作用后Erk1/2信號(hào)通路下游靶分子(c-Myc、Id1、Cox-2和VEGFA)的基因和蛋白水平以及Erk1/2的磷酸化程度均明顯升高。5.5采用U0126作用HMECs后,EPC-Exos對(duì)HMECs基因和蛋白的表達(dá)、增殖、成管和遷移功能的調(diào)控作用均消失。結(jié)論:1.局部移植EPC-Exos可提高糖尿病大鼠皮膚傷口愈合率,增強(qiáng)新生血管形成、表皮和膠原組織再生。2.EPC-Exos可通過(guò)激活Erk1/2信號(hào)通路增強(qiáng)HMECs的增殖、遷移和成管能力。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2

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本文編號(hào)：1312833