本文關(guān)鍵詞：miR-32-5p在小鼠血管平滑肌細(xì)胞中對(duì)PTEN表達(dá)調(diào)控的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)擬以小鼠血管平滑肌細(xì)胞為對(duì)象,探究miR-32-5p的靶向調(diào)控基因及其影響的細(xì)胞信號(hào)通路,為尋求血管鈣化有效的潛在干預(yù)靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.通過(guò)在線核酸數(shù)據(jù)庫(kù)獲取miR-32-5p的成熟序列,利用靶基因預(yù)測(cè)軟件并結(jié)合相關(guān)因素分析,篩選出miR-32-5p的靶基因。2.利用雙熒光素酶報(bào)告基因載體,驗(yàn)證miR-32-5p與預(yù)測(cè)目標(biāo)基因的靶向關(guān)系。3.構(gòu)建miR-32-5p mimic/miR-32-5p inhibitor轉(zhuǎn)染成功的小鼠血管平滑肌細(xì)胞并檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率。4.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot技術(shù)分別檢測(cè)miR-32-5p、預(yù)測(cè)目標(biāo)基因mRNA及其蛋白的表達(dá)。5.采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)上調(diào)小鼠血管平滑肌細(xì)胞miR-32-5p后對(duì)靶蛋白的下游調(diào)控蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1.利用miRanda、TargetScan、RNAhybrid等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù),結(jié)合生物信息學(xué)和文獻(xiàn)分析,發(fā)現(xiàn)PTEN為miR-32-5p的靶基因之一。2.轉(zhuǎn)染miR-32-5p mimic的血管平滑肌細(xì)胞miR-32-5p表達(dá)水平明顯上調(diào),PTEN蛋白表達(dá)水平降低;而轉(zhuǎn)染miR-32-5p inhibitor的血管平滑肌細(xì)胞miR-32-5p表達(dá)水平明顯下調(diào),PTEN蛋白水平顯著上升。而miR-32-5p mimic或miR-32-5p inhibitor的轉(zhuǎn)染對(duì)血管平滑肌細(xì)胞PTEN mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。3.基因測(cè)序結(jié)果表明,野生型(WT)及突變型(MUT)PTEN 3’UTR熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建成功,miR-32-5p mimic和WT-GV272-PTEN共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著下降,而miR-32-5p mimic和MUT-GV272-PTEN共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性無(wú)明顯變化,對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)野生型及突變型PTEN 3’UTR的熒光素酶活性均無(wú)影響。4.Western Blot技術(shù)檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染miR-32-5p mimic組,PTEN調(diào)控下游P-AKT明顯升高,RUNX2表示水平及RUNX2的磷酸化水平明顯升高,PI3K抑制物L(fēng)Y294002可降低RUNX2及AKT與RUNX2的磷酸化水平,對(duì)PTEN蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響。結(jié)論:1.miR-32-5p在小鼠血管平滑肌細(xì)胞中可通過(guò)靶向PTEN 3’UTR序列抑制PTEN的表達(dá),PTEN是miR-32-5p下游的調(diào)控靶基因。2.miR-32-5p可通過(guò)靶向抑制PTEN的表達(dá),進(jìn)而激活PI3K/AKT通路,提高RUNX2及RUNX2的磷酸化水平,促進(jìn)小鼠血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R587

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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本文編號(hào)：1304389