本文關(guān)鍵詞：自噬誘導(dǎo)和抑制對(duì)MIN6細(xì)胞株分化的作用初探

  更多相關(guān)文章： 糖尿病 自噬 ε/β細(xì)胞分化 Ghrelin Insulin mTOR Beclin1 Atg7 LC3 LAMP2 p62

【摘要】：背景和實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾悄虿“l(fā)病機(jī)制中有兩個(gè)重要環(huán)節(jié),就是胰島p細(xì)胞分泌胰島素不足和周?chē)M織的胰島素抵抗。如何促進(jìn)胰島p細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)p細(xì)胞再生并抑制p細(xì)胞凋亡是近年研究的熱點(diǎn)。胰島ε細(xì)胞與p細(xì)胞來(lái)源于共同的內(nèi)分泌前體細(xì)胞,通過(guò)內(nèi)源性機(jī)制保持分化的平衡。Ghrelin表達(dá)于ε細(xì)胞,insul in表達(dá)于p細(xì)胞。前期研究已發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不良新生大鼠胰島存在ε/p細(xì)胞分化失衡,其ε細(xì)胞數(shù)量和分布也與對(duì)照組顯著不同,且上述ε/p細(xì)胞失衡與后期糖尿病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。因此,明確ε/p分化失衡的機(jī)制有助于調(diào)控p細(xì)胞定向分化和增殖,是從發(fā)育早期干預(yù)和逆轉(zhuǎn)糖尿病進(jìn)程的重要切入點(diǎn)。新近的研究發(fā)現(xiàn),自噬在調(diào)控ε/p分化、防止p細(xì)胞凋亡、維持p細(xì)胞數(shù)量及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮極其重要的作用。自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)形成的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體,包裹所降解的物質(zhì)、大分子或細(xì)胞器,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物,以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。自噬相關(guān)蛋白7(autophagy-related protein 7, Atg7)是維持成年干細(xì)胞多向分化性的重要調(diào)節(jié)因子；雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的感受器,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)豐富時(shí),mTOR活化,通過(guò)抑制下游Atg蛋白,抑制自噬的發(fā)生；饑餓狀態(tài)時(shí)mTOR活化被抑制,Atg家族成員活化,促進(jìn)自噬體的形成。mTOR抑制因子及自噬活化因子能夠顯著提高誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞產(chǎn)生的速度和效率；自噬也有助于維持處于分化終點(diǎn)的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)�；谝陨媳尘�,自噬可能在胰島p細(xì)胞和ε細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)生作用,但具體機(jī)制尚不清楚。本研究擬用小鼠胰島細(xì)胞瘤MIN6細(xì)胞株為模型,在體外培養(yǎng),通過(guò)抑制或誘導(dǎo)劑調(diào)控自噬信號(hào),在培養(yǎng)的不同階段加入針對(duì)不同自噬階段抑制劑或誘導(dǎo)劑,觀察其對(duì)MIN6細(xì)胞株表達(dá)定向ghrelin分布和insulin的變化,以此推測(cè)其分化為ε/p細(xì)胞的潛能的變化,希望本結(jié)果可以為探索1型糖尿病的發(fā)生原因奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法：利用小鼠胰島素瘤MIN6細(xì)胞株,在培養(yǎng)的不同階段加入針對(duì)不同自噬階段的抑制劑或誘導(dǎo)劑,以PT-PCR、Western blot檢測(cè)其對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞自噬途徑中關(guān)鍵因子LC3、Atg7、LAMP2、p62等表達(dá)的影響,同時(shí)以免疫熒光檢測(cè)MN6細(xì)胞株表達(dá)ghrelin分布和insulin的變化,來(lái)探討自噬對(duì)胰島ε/p細(xì)胞分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.誘導(dǎo)／抑制自噬過(guò)程中幾種自噬調(diào)控蛋白與效應(yīng)蛋白的mRNA水平及蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),饑餓組細(xì)胞BECLIN1表達(dá)降低(P0.05),Atg7、LAMP-2基因表達(dá)增高,Lc3和P62基因未見(jiàn)明顯改變；3-MA組細(xì)胞中BECLn,基因和Lc3基因表達(dá)降低(P0.05),其余基因未見(jiàn)明顯的改變。Western-blotting對(duì)比檢測(cè)抑制／誘導(dǎo)組與正常對(duì)照組中LC3與p62、LAMP2的水平,相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞,饑餓組細(xì)胞P62蛋白水平堆積(P0.05), Lc3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)降低(P0.05)；3-MA組細(xì)胞中P62水平未見(jiàn)明顯變化,Lc3-Ⅱ/Ⅰ比例明顯降低(P0.05)。LAMP-2蛋白在三組細(xì)胞中的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。2. RT-PC R的結(jié)果同免疫熒光結(jié)果相一致,饑餓組細(xì)胞insulin基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高,3-MA組細(xì)胞insulin基因的轉(zhuǎn)錄水平則明顯降低,饑餓組和3-MA組ghrelin基因的轉(zhuǎn)錄水平都顯著降低。3.細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)的免疫熒光結(jié)果顯示,同對(duì)照組細(xì)胞相比,饑餓組細(xì)胞分泌insulin的細(xì)胞比例明顯升高,而3-MA組中分泌insulin的細(xì)胞比例則明顯降低。同對(duì)照組相比,饑餓組和3-MA組分泌ghrelin的細(xì)胞比例都明顯降低。結(jié)論：1.MIN6細(xì)胞株饑餓時(shí)出現(xiàn)insulin基因轉(zhuǎn)錄顯著增加,ghrelin基因轉(zhuǎn)錄顯著降低,提示ε/β失衡,從而說(shuō)明ε/p細(xì)胞失衡與饑餓誘導(dǎo)有關(guān)；2.從自噬相關(guān)途徑上的因子表達(dá)水平上,本實(shí)驗(yàn)中饑餓并沒(méi)有誘導(dǎo)出自噬的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1

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