本文關(guān)鍵詞：OLETF大鼠糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展不同階段視網(wǎng)膜的病理學(xué)改變及機制探討

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【摘要】：目的:糖尿病的并發(fā)癥主要包括大血管及微血管并發(fā)癥,其中常見的微血管并發(fā)癥有糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)和糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)。目前DN已成為導(dǎo)致終末期腎病(endstage renal disease,ESRD)的第一位病因,且缺乏有效的治療手段;而DR也已成為成人致盲的最主要原因之一。DN和DR的發(fā)病機制尚不完全清楚,但傳統(tǒng)觀點均認為高血糖及其異常代謝產(chǎn)物的形成是導(dǎo)致其血管損傷的病理基礎(chǔ),因此理論上,二者應(yīng)該是平行發(fā)展的。有觀點認為,糖尿病的微血管并發(fā)癥可能在起病后的同一時間出現(xiàn)。因此臨床上常把是否合并糖尿病視網(wǎng)膜病變作為DN的重要診斷依據(jù)之一。雖然多數(shù)研究都提示DN與DR的發(fā)病有一定相關(guān)性,但也并不完全平行。臨床觀察發(fā)現(xiàn)有些患者存在蛋白尿而無視網(wǎng)膜病變,或者有視網(wǎng)膜病變而無蛋白尿,亦或兩者均存在,但彼此間的嚴(yán)重程度并不一致。另外,越來越多的研究提示,腎臟在糖耐量減低(impaired glucose tolerance,IGT)的糖尿病前期,即已出現(xiàn)不同程度的結(jié)構(gòu)和功能改變。為了進一步觀察糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變間的相關(guān)性,我們同步觀察了OLETF大鼠糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展不同階段視網(wǎng)膜的病理學(xué)變化,并對其發(fā)病機制進行探討。本研究以自發(fā)2型DM動物模型OLETF大鼠為研究對象,觀察大鼠糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的各個時期:正常糖耐量(normal glucose tolerance,NGT)期、糖耐量減低(impaired glucose tolerance,IGT)期、DM期及DN期視網(wǎng)膜的病理學(xué)改變,并從炎癥、缺血缺氧及血-視網(wǎng)膜屏障損傷等角度探討糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生機制,以期為糖尿病微血管并發(fā)癥的早期防治提供理論參考。方法:1)SPF級雄性O(shè)LETF大鼠45只,高脂飼料喂養(yǎng);LETO大鼠30只予普通飼料飲食。LETO大鼠作為OLETF大鼠的正常對照鼠,同系不同株,不發(fā)生DM。2)大鼠體重每周監(jiān)測一次;空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)采用剪尾法測量;每2周留取24h尿檢測24h尿微量白蛋白;每2周空腹尾靜脈取血用于腎功能:尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,SCr)及血脂如總膽固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三酯(triglyeride,TG)、游離脂肪酸(freefattyacid,ffa)等的檢測;血清中的白細胞介素-6(interleukin-6,il-6)及腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)法檢測。大鼠每4周做一次口服葡萄糖耐量試驗(oralglucosetolerancetest,ogtt),糖負荷后血糖峰值16.8mmol/l,120min血糖值11.1mmol/l,二者滿足其一則為igt期;兩者均符合則為dm期;直至兩組大鼠24huma含量出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異時則為dn期。3)于oletf大鼠糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的各個時期(ngt、igt、dm和dn期)隨機處死6只大鼠,同時處死6只與其各個時期相對應(yīng)的leto大鼠,并留取視網(wǎng)膜組織。采用光鏡、透射電鏡觀察大鼠視網(wǎng)膜的病理學(xué)形態(tài)變化;免疫組化法及rt-pcr檢測糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中視網(wǎng)膜組織hif-1α、inos、nf-κb、vegf、icam-1、mmp-9、occludin的表達,以探討炎癥、缺氧缺氧及brb損傷與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系。結(jié)果:1)ogtt結(jié)果及一般資料分析:oletf大鼠在8周齡時,其ogtt各個時間點的血糖值與同期leto大鼠相比均未見異常(p0.05),符合ngt期特點。在30周齡時,oletf大鼠除了fbg沒有升高外,其余各個時間點的血糖值與同期leto大鼠相比均升高(p0.05),且高峰值為18.24±4.08mmol/l(大于16.8mmol/l),120min的血糖值為9.55±2.06mmol/l,符合igt特點。在56周齡及65周齡時,oletf大鼠在各個時間點的血糖值均比同期leto大鼠的血糖值高(p0.05),高峰值分別為18.61±3.93mmol/l、19.36±5.17mmol/l(均大于16.8mmol/l),120min的血糖值分別為13.25±6.72mmol/l、13.54±6.66mmol/l(均大于11.1mmol/l),符合dm期特點。oletf大鼠的體重、ffa、tg在igt期即已高于同期leto大鼠及ngt期oletf大鼠(p0.05);同樣,tc在igt期也高于同期leto大鼠及ngt期oletf大鼠(p0.05)且在dn期進一步升高(p0.05)。fins雖然在igt期比同期leto大鼠及ngt期oletf大鼠(p0.05)高,但在dm期開始降低(p0.05),至dn期進一步降低(p0.05)。以上資料表明我們成功復(fù)制了2型糖尿病動物模型。2)24huma結(jié)果:oletf大鼠在ngt期其24huma與同期leto大鼠相比未見明顯差異(p0.05);在igt及dm期24huma逐漸升高,但與同期leto大鼠相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);直至dn期其24huma與同期leto大鼠相比出現(xiàn)顯著升高(p0.05)。24huma變化結(jié)果表明,我們成功復(fù)制了糖尿病腎病模型。3)oletf大鼠視網(wǎng)膜he結(jié)果:ngt期oletf大鼠與對照組間無明顯變化;igt期oletf大鼠神經(jīng)節(jié)細胞層間質(zhì)水腫,內(nèi)界膜表面不平、節(jié)細胞數(shù)量減少;dm期oletf大鼠視網(wǎng)膜除了節(jié)細胞層水腫外,內(nèi)、外核層也出現(xiàn)水腫,且神經(jīng)節(jié)細胞明顯減少,顆粒層變薄、細胞稀疏排列紊亂,光感受器細胞層細胞結(jié)構(gòu)紊亂;dn期oletf大鼠視網(wǎng)膜各層水腫,神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量進一步減少,內(nèi)核層變薄,并可見突破內(nèi)界膜的新生血管及外叢狀層異常的新生血管。4)oletf大鼠視網(wǎng)膜電鏡結(jié)果:ngt期:oletf大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層、神經(jīng)節(jié)細胞層、外核層及視網(wǎng)膜膜盤與對照組均無明顯變化。igt期:oletf大鼠:(1)視網(wǎng)膜內(nèi)核層:內(nèi)核層細胞排列尚整齊,但出現(xiàn)細胞水腫;(2)神經(jīng)節(jié)細胞層:神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)異常,線粒體腫脹、嵴模糊、空泡樣變;(3)視網(wǎng)膜外核層:外核層細胞排列出現(xiàn)不規(guī)則;(4)視網(wǎng)膜膜盤:膜盤模糊,出現(xiàn)斷裂。dm期:oletf大鼠:(1)視網(wǎng)膜內(nèi)核層:內(nèi)核層細胞染色質(zhì)分布不均,細胞膜模糊,細胞水腫,胞質(zhì)出現(xiàn)空泡;(2)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層:神經(jīng)節(jié)細胞線粒體腫脹明顯,細胞器減少,胞質(zhì)空泡變性加重;(3)視網(wǎng)膜外核層:外核層排列紊亂,間隙變大;(4)視網(wǎng)膜膜盤:感光細胞可見膜盤間隙增寬,數(shù)量減少。dn期:oletf大鼠:(1)視網(wǎng)膜內(nèi)核層:內(nèi)核層細胞空泡變性進一步加重,胞核碎裂;(2)神經(jīng)節(jié)細胞層:神經(jīng)節(jié)細胞胞質(zhì)空泡變性進一步加重,核膜模糊、胞核固縮;(3)視網(wǎng)膜外核層:外核層排列紊亂,間隙進一步變大,胞質(zhì)空泡變性;(4)視網(wǎng)膜膜盤:感光細胞可見膜盤間隙進一步增寬、數(shù)量進一步減少。5)oletf大鼠視網(wǎng)膜血-視網(wǎng)膜屏障相關(guān)指標(biāo)免疫組化表達:occludin:ngt期與正常對照leto大鼠的表達無明顯差異,主要在視網(wǎng)膜富含血管的神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)核層及外核層表達;至igt期其在神經(jīng)節(jié)細胞層血管細胞中的表達開始減少;dm及dn期表達減少更明顯。6)oletf大鼠視網(wǎng)膜炎癥相關(guān)指標(biāo)免疫組化表達:(1)vegf:ngt期其主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層表達;igt期視網(wǎng)膜內(nèi)核層也開始高表達;dm期vegf在視網(wǎng)膜外核層也開始表達;至dn期其在各層表達量進一步增加,幾乎視網(wǎng)膜全層均有陽性表達,即隨著糖尿病病程的進展,vegf在視網(wǎng)膜的表達逐漸增高;(2)icam-1:早期其主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)核層表達,隨著糖尿病病程的進展,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層表達逐漸增多,到后期外核層也有表達;(3)MMP-9:早期主要在視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層表達,隨著糖尿病病程的進展,視網(wǎng)膜外叢狀層也有表達,且表達量逐漸增多;(4)NF-κB:NGT期主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層表達,IGT期內(nèi)核層表達明顯增多,DM期外核層也高表達,至DN期幾乎視網(wǎng)膜全層均可見陽性表達。7)OLETF大鼠視網(wǎng)膜缺血缺氧相關(guān)指標(biāo)表達:(1)HIF-1α:NGT期其主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層胞漿表達,內(nèi)核層也有少量表達;至IGT期內(nèi)核層表達明顯增多,隨著糖尿病病程進展,外核層也有表達,甚至可看到HIF-1α由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核;(2)iNOS:早期主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層表達,且iNOS表達在OLETF大鼠NGT、IGT期與正常對照LETO大鼠無明顯差異,至DM期iNOS在內(nèi)核層表達明顯增多,至DN期幾乎視網(wǎng)膜全層均有陽性表達。結(jié)論:1)成功復(fù)制了2型糖尿病模型。2)成功復(fù)制了2型糖尿病腎病動物模型。3)OLETF大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展不同階段,其病理學(xué)表現(xiàn)不同,且隨病程進展其組織結(jié)構(gòu)損傷逐漸加重,早期主要以視網(wǎng)膜內(nèi)層受損為主,尤其是神經(jīng)節(jié)細胞層。4)OLETF大鼠早期即可出現(xiàn)視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化:IGT期即可觀察到神經(jīng)節(jié)細胞層出現(xiàn)間質(zhì)水腫,神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少。電鏡下視網(wǎng)膜內(nèi)核層、神經(jīng)節(jié)細胞層出現(xiàn)水腫,膜盤模糊,出現(xiàn)斷裂,但是外核層損傷不明顯。5)高血糖導(dǎo)致的代謝異常,進一步誘導(dǎo)視網(wǎng)膜組織炎癥反應(yīng)及缺血、缺氧,并參與了DR的發(fā)生。6)血-視網(wǎng)膜屏障的損傷也參與了DR的發(fā)生、發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R692.9

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本文編號：1202187