本文關(guān)鍵詞：重癥肌無力患者肌細胞分揀微管連接蛋白17的表達及作用分析

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【摘要】：研究背景重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是最常見的神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)免疫疾病,世界范圍內(nèi)發(fā)病率約為200-300/百萬,臨床特點包括肌肉無力和易疲勞性,肌無力通常會在活動后加重,休息或睡眠后緩解。神經(jīng)肌肉接頭是由高度特化的運動神經(jīng)元構(gòu)成的突觸前膜、突觸間隙、以及由肌細胞膜構(gòu)成的突觸后膜組成,作用是參與神經(jīng)肌肉之間的信號傳導(dǎo),將神經(jīng)興奮信號轉(zhuǎn)化為肌肉收縮。運動神經(jīng)元末梢釋放乙酰膽堿(ACh)活化突觸后膜的乙酰膽堿受體(AChR),導(dǎo)致肌細胞膜表面離子通道開放,使肌細胞去極化。AChR在反復(fù)折疊的突觸后膜呈高密度簇集分布,這種簇集分布是信號傳導(dǎo)的重要保證。哺乳動物在出生以后,神經(jīng)肌肉接頭的突觸后膜形成褶皺樣結(jié)構(gòu),AChR聚集在這些褶皺上,經(jīng)過測算可知其在突觸后膜上的10000-20000/um2,而在突觸外的結(jié)構(gòu)上密度僅為10/um2,這種現(xiàn)象涉及復(fù)雜的NMJ處的信號傳遞通路,目前關(guān)于AChR在NMJ的調(diào)節(jié)及聚集機制仍不明確。過去的幾十年中,已經(jīng)證實神經(jīng)肌肉接頭處有很多神經(jīng)源性、肌源性以及促進不同分化的信號因子。這些因子包含跨膜蛋白、胞質(zhì)內(nèi)蛋白、以及胞外的一些重要蛋白,突觸處的基本蛋白包含兩種主要物質(zhì)即集聚蛋白(Agrin)和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白,這兩種物質(zhì)由運動神經(jīng)元產(chǎn)生,并且在NMJ的結(jié)構(gòu)形成和維持方面有一定作用,其它的胞外蛋白如層聯(lián)蛋白、IV/XIII膠原蛋白,蛋白多糖對NMJ形成也有一定作用。在肌細胞膜表面,肌肉特異性酪氨酸激酶(MuSK)是募集其它胞內(nèi)、胞外物質(zhì)的關(guān)鍵蛋白。膜表面低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(LRP4)與MuSK形成的復(fù)合體對于NMJ的功能至關(guān)重要。在肌細胞內(nèi)部,很多蛋白如rapsyn蛋白、Dok7可以和MuSK結(jié)合傳遞信號誘導(dǎo)AChR在突觸后膜的聚集。目前,研究者普遍認為Agrin-LRP4-MuSK復(fù)合體的信號傳遞通路在NMJ形過程起到重要作用,目前對這個復(fù)合體功能已有一定的認識,AChR的簇集需要運動神經(jīng)元分泌的Agrin蛋白和突觸后膜的LRP4蛋白結(jié)合,Agrin-LRP4復(fù)合體激活突觸后膜MuSK蛋白,誘導(dǎo)AChR在突觸后膜聚集。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(LRP4)與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)均屬于LDLR家族成員,研究已經(jīng)表明LRP1在細胞內(nèi)的代謝與細胞分揀微管連接蛋白17(SNX17)有關(guān),SNX17屬于細胞分揀微管連接蛋白(sorting nexin,SNX)家族成員,SNX家族包括存在于胞內(nèi)和胞膜的多種蛋白質(zhì),其作用是參與跨膜蛋白的內(nèi)吞及在胞質(zhì)內(nèi)的分揀,SNX17蛋白誘導(dǎo)LRP1在細胞內(nèi)的循環(huán)利用,抑制LRP1被溶酶體降解,LRP1與LRP4具有相同的結(jié)構(gòu)域即NPxY結(jié)構(gòu)域,因此LRP4存在與SNX17結(jié)合的可能。SNX17分布于所有組織,我們研究團隊前期研究發(fā)現(xiàn)MG患者胸腺中SNX17mRNA含量明顯增高,但SNX17在肌肉的表達情況及對NMJ處LRP4代謝影響情況未知。本研究在比較MG患者SNX17分子含量基礎(chǔ)上,用免疫熒光觀察SNX17與AChR形態(tài),了解MG患者肌細胞SNX17分子表達情況,分析與AChR分子的關(guān)系。目的本研究采用免疫熒光法觀察肌絲AChR、SNX17分子形態(tài)及分布;熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法比較兩組肌細胞SNX17含量。方法1.免疫熒光法觀察大鼠AChR及人AChR、SNX17分子形態(tài):取大鼠、MG組和對照組肋間肌標(biāo)本,4%多聚甲醛固定10 min,在載玻片上的剝離單根肌絲,0.5%Triton X-100通透20 min,5%BSA封閉1 h,稀釋比例1:50的鼠抗人SNX17抗體孵育4℃過夜。37℃復(fù)溫30 min,稀釋比例1:100的AF-g350標(biāo)記羊抗鼠抗體及1:220的α-銀環(huán)蛇毒素標(biāo)記的四甲基羅丹明(α-BTX),37℃孵育1 h,顯微鏡觀察不同激發(fā)光下的AChR、SNX17形態(tài)及分布。2.熒光定量PCR法檢測肌細胞SNX17 mRNA含量:在Gene Bank中獲得人SNX17序列,Premier5.0設(shè)計引物,上游引物序列5,-CAATGGGT CTTGCCGAACAG-3,,下游引物序列5,CGCCTACGTGGCCTATAACAT-3,。β-actin作為內(nèi)參,其上游引物序列為5,-GGGCCGGACTCGTCATACT-3,,下游引物序列為5,-CCTGGCACCCAGCACAAT-3,。取上述肋間肌各20mg,用Trizol一步法提取RNA,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA,熒光定量PCR法采用20ul反應(yīng)體系,熒光變性反應(yīng)條件為95℃30S;PCR反應(yīng)條件:95℃5 S、55℃2 min、72℃30 S,40個循環(huán);取10ul PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,以確保引物設(shè)計的特異性。將內(nèi)參基因Ct值與目的基因的Ct值之比作為標(biāo)準化的目的基因相對定量,即β-actin的拷貝數(shù)/目的基因拷貝數(shù)。3.蛋白免疫印跡法檢測肌細胞SNX17蛋白含量:取上述肋間肌各20mg,液氮中快速研磨得到勻漿,加入裂解液,室溫避光30 min,5000 r/min離心5 min后取上清,BCA法測細胞蛋白濃度,每孔加20μl樣品,β-actin作為內(nèi)參,稀釋比例1:1000鼠抗人SNX17抗體及1:2000兔抗人β-actin抗體孵育4℃過夜,37℃復(fù)溫30 min,稀釋比例1:4000 HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體和1:4000 HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體37℃孵育1 h,曝光成膠片,采用圖像分析軟件Quantity One分別測定目的基因和β-actin的顯色條帶平均值,各組蛋白表達強度為二者平均值比值。結(jié)果1.患者一般臨床資料:對MG組(10例)與對照組(14例)的年齡、性別進行比較,兩組患者的年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。2.AChR、SNX17形態(tài)學(xué)觀察:AChR一般位于肌纖維縱軸的中部,呈紅色橢圓形突起狀,輪廓線光滑連續(xù)完整。對照組AChR呈曲奇餅干樣,內(nèi)部有精細分支的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu);而MG組僅可觀察到呈不連續(xù)完整的紅色外周輪廓線,內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破碎,呈空泡樣;但可觀察到SNX17呈同樣形狀藍色橢圓形突起,兩者位置、形態(tài)一致,經(jīng)Merge后,圖像完全重疊(圖1、圖2)。3.肌細胞中SNX17基因和蛋白定量結(jié)果:熒光定量PCR法結(jié)果顯示,MG組SNX17 mRNA含量明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.75,P0.05),蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示,SNX17蛋白含量明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.03,P0.05)(圖3,表1)。結(jié)論(1)MG患者肋間肌肌細胞SNX17表達增高,存在促進LRP4在細胞內(nèi)再循環(huán)的可能性。(2)SNX17與AChR在神經(jīng)肌肉接頭處共定位,促進AChR聚集,是維護神經(jīng)肌肉接頭信號通路完整的重要分子。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R746.1

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本文編號：1176787