本文關鍵詞：含人干細胞白血病基因慢病毒載體轉染Cajal樣間質細胞的效果研究

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【摘要】：目的觀察攜帶增強綠色熒光蛋白(GFP)的含人干細胞白血病(SCL)基因慢病毒載體轉染體外培養(yǎng)的豚鼠膀胱Cajal樣間質細胞(ICC)的效果。方法 2014年10月—2015年8月,選取普通級成年健康豚鼠16只。構建含人SCL基因的慢病毒載體,并標定病毒滴度;采用隨機數字表法選取健康豚鼠4只,采用頸椎脫臼方法將其殺死,體外培養(yǎng)豚鼠膀胱ICC。設置不同感染復數(MOI)(0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0),利用含人SCL基因的慢病毒載體轉染ICC,在激光共聚焦顯微鏡下觀察ICC生長狀態(tài)并計算轉染效率,確定最佳MOI。采用隨機數字表法將ICC分為正常對照組、空白質粒對照組與慢病毒轉染組,其中正常對照組加入1%磷酸鹽緩沖液(PBS),空白質粒對照組加入空慢病毒,慢病毒轉染組按最佳MOI加入含人SCL基因的慢病毒載體,計算各組轉染效率,確定最佳轉染時間。采用反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測SCL mRNA表達情況。上述實驗均獨立重復4次。結果經測定,病毒滴度為5×10~8TU/ml。倒置顯微鏡下發(fā)現一些特征性梭形細胞,其兩側有顯著外凸分枝,細胞核較大,其外形規(guī)則,有序地實現細胞貼壁,而其他未貼壁細胞則呈現與ICC不一樣的形態(tài),胞體多為橢圓形,細胞兩極無突起,整體形狀扁平。激光共聚焦顯微鏡下可以發(fā)現酪氨酸蛋白激酶生長因子受體(c-kit)受體成功表達,證實培養(yǎng)的細胞是膀胱ICC。觀察各組ICC生長狀態(tài),當MOI為0.5、1.0、5.0、10.0時,細胞生長狀態(tài)較好,無細胞死亡,當MOI為50.0、100.0時,可見部分細胞死亡,細胞活性降低;MOI為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0時的轉染效率高于MOI為0.5時(P0.05);MOI為5.0、10.0、50.0、100.0時的轉染效率高于MOI為1.0時(P0.05);MOI為10.0、50.0、100.0時的轉染效率高于MOI為5.0時(P0.05);MOI為50.0、100.0時的轉染效率高于MOI為10.0時(P0.05);綜合ICC生長狀態(tài)及轉染效率,確定含人SCL基因慢病毒載體轉染ICC的最佳MOI為10.0。正常對照組、空白質粒對照組ICC中無GFP表達;慢病毒轉染組轉染3 d時ICC中GFP表達強度高于轉染2 d、轉染5 d時,確定含人SCL基因慢病毒載體轉染ICC的最佳轉染時間為3 d。慢病毒轉染組中擴增產物大小與目的片段大小1 036 bp一致,而正常對照組及空白質粒對照組均未見特異性條帶表達,表明SCL基因成功導入ICC。結論利用含人SCL基因慢病毒載體能高效轉染體外培養(yǎng)的ICC,并成功介導SCL基因在ICC中的表達,為下一步研究利用SCL基因進行體內轉染實驗奠定基礎。
【作者單位】： 石河子大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院泌尿外科;
【基金】：國家自然科學基金資助項目(81360120)
【分類號】：R587.2
【正文快照】： 糖尿病膀胱異常病癥(DCP)是糖尿病末期出現頻率最高的并發(fā)癥之一,在糖尿病患者中的發(fā)病率為19%~84%[1-2]。DCP在發(fā)病末期會出現尿路感染、腎炎等,之后發(fā)展成尿毒癥[3-4]。相關研究發(fā)現,神經生長因子(nerve growth factor,NGF)水平下降、氧化自由基形成、糖代謝異常、前列腺素E

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