發(fā)布時(shí)間：2017-11-08 14:07

  本文關(guān)鍵詞：GSK3β在TNAP缺乏導(dǎo)致的牙硬組織礦化異常中的作用

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【摘要】：低堿性磷酸酯酶癥(Hypophosphatasia,HPP)是一種罕見(jiàn)的系統(tǒng)性遺傳疾病。主要由于ALPL基因突變導(dǎo)致組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)活性降低從而引起骨和牙礦化代謝的異常。TNAP在骨與牙等硬組織的礦化過(guò)程中具有重要作用。最新研究表明,TNAP缺乏不僅僅會(huì)直接抑制礦化過(guò)程,還可能通過(guò)微環(huán)境影響相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。間充質(zhì)干細(xì)胞及其微環(huán)境是維持相關(guān)組織正常發(fā)育的重要基礎(chǔ),且在組織更新和修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在基因缺陷情況下干細(xì)胞表現(xiàn)出的細(xì)胞生物學(xué)行為將直接關(guān)系到患者的臨床表現(xiàn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),來(lái)源于HPP患兒的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)存在分化能力異常,同時(shí)Active-β-catenin表達(dá)降低,提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路可能參與了低ALP活性條件下干細(xì)胞功能的改變。但與牙齒發(fā)育礦化密切相關(guān)的牙髓干細(xì)胞(DPSC)及牙周膜干細(xì)胞(PDLSC),其在ALPL基因異常情況下功能的改變尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬研究DPSC和PDLSC在TNAP缺乏時(shí)的功能改變以及相關(guān)機(jī)制,在此基礎(chǔ)上,初步探索利用恢復(fù)干細(xì)胞功能來(lái)治療HPP相關(guān)異常的可能性。研究主要由以下幾個(gè)方面逐步進(jìn)行:第一,以ALPL基因敲除小鼠Akp2+/-為模型,觀察敲除ALPL基因?qū)ρ例X硬組織的影響;第二,通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方法敲減正常人來(lái)源的hPDLSC與hDPSC中的ALPL基因,觀察敲減ALPL基因?qū)Ω杉?xì)胞功能的影響,同時(shí)檢測(cè)GSK3β及相關(guān)信號(hào)通路的變化;第三,觀察GSK3β磷酸化抑制劑LiCl對(duì)ALPL基因敲減后hPDLSC與hDPSC功能的影響;第四,觀察LiCl對(duì)Akp2+/-小鼠牙及牙槽骨異常的恢復(fù)作用,以此驗(yàn)證GSK3β及間充質(zhì)干細(xì)胞在TNAP功能異常導(dǎo)致的牙硬組織礦化異常中的作用。第一部分ALPL基因敲除對(duì)小鼠牙硬組織的影響研究目的觀察ALPL基因敲除對(duì)小鼠牙及牙槽骨的影響。研究方法(1)Micro-CT掃描野生型與Akp2+/-小鼠單側(cè)下頜骨,觀察Akp2+/-小鼠牙及牙槽骨的改變;選取第一磨牙冠部牙本質(zhì)進(jìn)行組織礦化密度定量分析。(2)掃描電鏡觀察野生型與Akp2+/-小鼠牙本質(zhì)的礦化情況。研究結(jié)果(1)Micro-CT觀察,比較于野生型,Akp2+/-小鼠的頜骨及牙槽骨存在明顯缺損,牙齒牙髓腔擴(kuò)大;(2)電鏡掃描結(jié)果可見(jiàn),與野生型比較,Akp2+/-小鼠牙本質(zhì)礦化程度低,可見(jiàn)膠原纖維暴露。結(jié)論相比較于野生型小鼠,Akp2+/-小鼠存在不同程度的牙槽骨缺損以及牙本質(zhì)礦化不全。第二部分ALPL基因敲減對(duì)hPDLSC與hDPSC干細(xì)胞功能的影響研究目的驗(yàn)證ALPL基因突變對(duì)hPDLSC和hDPSC干細(xì)胞功能的影響。研究方法(1)體外培養(yǎng)正常人來(lái)源hPDLSC與hDPSC,通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方法敲減hPDLSC和hDPSC中的ALPL基因;在此基礎(chǔ)上用Western-Blot和茜素紅染色法檢測(cè)敲減后hPDLSC和hDPSC成骨能力的改變;(2)Western-Blot檢測(cè)敲減后hPDLSC與hDPSC中的P-GSK3β表達(dá)。研究結(jié)果(1)Western-Blot結(jié)果可見(jiàn),ALPL敲減后,hPDLSC與hDPSC中ALP蛋白表達(dá)量下降,其它成骨相關(guān)蛋白表達(dá)均下降;hDPSC中DSP表達(dá)下降。(2)敲減ALPL后,茜素紅染色結(jié)果可見(jiàn)hPDLSC與hDPSC成骨能力下降。(3)敲減ALPL后,Western-Blot結(jié)果可見(jiàn)hPDLSC與hDPSC中P-GSK3β表達(dá)量下降。結(jié)論(1)通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染法可以有效地敲減hPDLSC與hDPSC中的ALPL基因,并且在敲減后,hPDLSC與hDPSC的成骨能力受到抑制;(2)在敲減ALPL后,hPDLSC與hDPSC中P-GSK3β表達(dá)下降,提示W(wǎng)nt信號(hào)通路受到抑制。第三部分GSK3β抑制劑對(duì)ALPL敲減hPDLSC與hDPSC功能的影響研究目的觀察LiCl對(duì)ALPL敲減hPDLSC與hDPSC成骨能力的影響,驗(yàn)證GSK3β在ALPL基因突變導(dǎo)致的干細(xì)胞功能異常中的作用。研究方法成骨誘導(dǎo)ALPL敲減后的hPDLSC和hDPSC,在誘導(dǎo)過(guò)程中加入GSK3β抑制劑LiCl;成骨誘導(dǎo)21d時(shí),茜素紅染色觀察其成骨能力的改變。研究結(jié)果茜素紅染色結(jié)果可見(jiàn),在成骨誘導(dǎo)過(guò)程中加入LiCl后,hPDLSC與hDPSC成骨能力明顯提高。結(jié)論在成骨誘導(dǎo)過(guò)程中通過(guò)抑制GSK3β而激活Wnt信號(hào)通路,可以使ALPL敲減hPDLSC和hDPSC的成骨能力提高,驗(yàn)證了ALPL基因突變是通過(guò)GSK3β影響干細(xì)胞的成骨能力。第四部分GSK3β抑制劑對(duì)于Akp2+/-小鼠牙硬組織異常的作用研究目的觀察LiCl對(duì)Akp2+/-小鼠牙硬組織異常的作用研究方法對(duì)Akp2+/-小鼠注射LiCl(100mg/Kg),與Akp2+/-小鼠作比較,應(yīng)用Micro-CT和掃描電鏡觀察注射后牙槽骨缺損以及牙本質(zhì)礦化程度的變化。研究結(jié)果(1)Micro-CT結(jié)果可見(jiàn),比較與對(duì)照組,注射組小鼠牙槽骨缺損得到明顯改善;(2)掃描電鏡觀察,注射組小鼠牙本質(zhì)礦化程度明顯升高。結(jié)論通過(guò)注射GSK3β抑制劑LiCl,Akp2+/-小鼠牙及牙槽骨異常得到明顯改善;證明ALPL基因突變可能會(huì)通過(guò)GSK3β等信號(hào)通路而影響牙來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的功能,最終導(dǎo)致牙及牙周組織發(fā)育礦化異常。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R596;R781

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1 陳琦;GSK3β在TNAP缺乏導(dǎo)致的牙硬組織礦化異常中的作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1157433