本文關(guān)鍵詞：甲磺酸去鐵胺對(duì)“Ⅰ型鐵蓄積骨質(zhì)疏松癥”干預(yù)及部分機(jī)制的實(shí)驗(yàn)觀察

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【摘要】：第一部分甲磺酸去鐵胺對(duì)小鼠“Ⅰ型鐵蓄積骨質(zhì)疏松癥”干預(yù)后骨量變化目的:本研究旨在探討鐵螯合劑甲磺酸去鐵胺(DFO)對(duì)去勢(shì)后枸櫞酸鐵銨(FAC)干預(yù)的雌性小鼠(模擬“I型鐵蓄積骨質(zhì)疏松癥小鼠模型”)骨量的影響,為“I型鐵蓄積骨質(zhì)疏松癥”探索新的治療方案。方法:選取2月齡C57BL/6雌性小鼠24只,隨機(jī)分為去勢(shì)(OVX)組、去勢(shì)+鐵劑干預(yù)組(OVX+Fe組)、去勢(shì)+鐵劑+去鐵胺組(OVX+Fe+DFO組)。三組均行雙側(cè)卵巢切除術(shù),后兩組在去勢(shì)后一周采用0.12g/kg/w的枸櫞酸鐵銨干預(yù)6周,干預(yù)方法為腹腔注射,每周干預(yù)三次,OVX組采用同樣方式和頻次的生理鹽水干預(yù)。隨后OVX+Fe+DFO組采用4000mg/kg/w的DFO干預(yù)2周,干預(yù)方法為腹腔注射,一日兩次,其他兩組給予同樣方式和頻次的生理鹽水干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后處死小鼠,在處死小鼠的前10天及前3天給小鼠腹腔注射鈣黃綠素。處死小鼠后分離雙側(cè)小鼠股骨,HE染色及微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(Micro-CT)觀察股骨遠(yuǎn)端微結(jié)構(gòu),鈣黃綠素標(biāo)記骨形成速率,普魯士藍(lán)染色觀察股骨局部鐵蓄積,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)檢測(cè)骨組織骨保護(hù)素(OPG)、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)的表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)小鼠血清鐵蛋白、OPG和RANKL水平。結(jié)果:血清鐵蛋白水平方面,OVX+Fe組(408.90±17.20μg/ml)明顯高于OVX組(87.53±3.73μg/ml)和OVX+Fe+DFO組(162.30±10.58μg/ml)(P0.05)。普魯士藍(lán)染色顯示股骨鐵蓄積OVX組OVX+Fe+DFO組OVX+Fe組。OVX+Fe組(0.09±0.02mg/mm3)比OVX組(0.13±0.01mg/mm3)的骨密度低(P0.05),OVX+Fe+DFO組(0.12±0.01mg/mm3)比OVX+Fe組(0.09±0.02 mg/mm3)的骨密度高(P0.05)。鈣黃綠素標(biāo)記顯示:OVX+Fe組比OVX組兩次標(biāo)記線之間的間隔短,MAR小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);OVX+Fe+DFO組比OVX+Fe組兩次標(biāo)記間的間隔長,MAR較大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);OVX+Fe+DFO組比OVX組標(biāo)記間的間隔短,MAR小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。OVX+Fe組(0.75±0.15)骨組織對(duì)OPG基因表達(dá)水平低于OVX組(1±0.2)和OVX+Fe+DFO組(0.89±0.15)(P0.05),OVX+Fe組(2.2±0.12)骨組織對(duì)RANKL基因表達(dá)水平高于OVX組(1±0.13)和OVX+Fe+DFO組(1.3±0.2)(P0.05),OVX+Fe組(2.8±0.4)骨組織對(duì)基因RANKL/OPG的表達(dá)比值高于OVX組(1±0.5)和OVX+Fe+DFO組(1.4±0.3)(P0.05)。OVX+Fe組(1.22±0.18 ug/L)血清OPG含量低于OVX組(2.33±0.33 ug/L)和OVX+Fe+DFO組(2.18±0.25 ug/L)(P0.05),OVX+Fe組(484.30±22.87 ng/L)血清RANKL含量高于OVX組(216.40±21.18 ng/L)和OVX+Fe+DFO組(289.70±20.76ng/L)(P0.05)。結(jié)論:DFO對(duì)“I型鐵蓄積骨質(zhì)疏松癥”小鼠模型的骨量有恢復(fù)作用,DFO的干預(yù)作用與成骨和破骨功能都有關(guān)聯(lián)。第二部分含鐵環(huán)境中原代成骨細(xì)胞在甲磺酸去鐵胺(DFO)干預(yù)后的生物活性變化及機(jī)制研究目的:研究甲磺酸去鐵胺(DFO)對(duì)于含鐵環(huán)境原代成骨細(xì)胞(FAC干預(yù))活性的影響,并探究其可能的機(jī)制。方法:通過顱骨酶消化法從C57BL/6小鼠出生三天內(nèi)胎鼠的顱蓋骨分離原代成骨細(xì)胞(Osteoblast,OB),進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)、堿性磷酸酶染色鑒定后,傳代培養(yǎng)至第三代。用CCK8法分別確定FAC及DFO的干預(yù)濃度后,分為3組:對(duì)照組,50u M/LFe(FAC)干預(yù)組,Fe+DFO組(50u M/LFe干預(yù)同時(shí)加入20u M/LDFO)。干預(yù)后三組細(xì)胞分別行堿性磷酸酶染色和活性定量,茜素紅染色和結(jié)節(jié)計(jì)數(shù),對(duì)相關(guān)基因(Runx2,Sp7,Bglap,Axin2,OPG,Sod1)進(jìn)行定量PCR檢測(cè)其m RNA的表達(dá)水平,DCFH熒光探針分析各組活性氧水平。將50u M/LFe(FAC)干預(yù)的原代成骨細(xì)胞,分為四組,分別用0,5,10,20 u M/LDFO干預(yù)后,行茜素紅染色并計(jì)數(shù),DCFH熒光探針分析各組活性氧水平,Westernblot檢測(cè)Axin2蛋白表達(dá)水平。再將原代成骨細(xì)胞分為4組,分別為對(duì)照組,50u M/LFe干預(yù)組,Fe+DFO組(50u M/LFe干預(yù)同時(shí)加入20u M/LDFO),Fe+DFO+DKK-1組(50u M/LFe干預(yù)同時(shí)加入20u M/LDFO+500ng/ml DKK-1),用DCFH熒光探針分析各組活性氧水平,Westernblot檢測(cè)Axin2及OPG蛋白表達(dá)水平,用茜素紅染色檢測(cè)其礦化能力。結(jié)果:CCK8結(jié)果顯示,Fe50u M/L,DFO20u M/L干預(yù),不影響細(xì)胞活性,各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與對(duì)照組相比,Fe劑干預(yù)組,成骨相關(guān)基因Runx2,Sp7,Bglap,Axin2,OPG表達(dá)下降,而氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)Sod1表達(dá)上升,而Fe+DFO干預(yù)組與Fe干預(yù)組相比成骨相關(guān)基因表達(dá)上升,氧化應(yīng)激指標(biāo)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ALP染色及活性定量定量和茜素紅染色及結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比,Fe組下降,而Fe+DFO組比Fe組上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。DCFH熒光顯示活性氧水平,Fe組明顯高于對(duì)照組,Fe+DFO組低于Fe組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。對(duì)50u M/LFe(FAC)干預(yù)的原代成骨細(xì)胞分別行0,5,10,20u M/LDFO干預(yù)。茜素紅染色及結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)顯示隨著DFO濃度增加,結(jié)節(jié)數(shù)量增加;Westernblot顯示Axin2蛋白表達(dá)水平隨著DFO濃度增加而增加;DCFH熒光顯示隨著DFO濃度上升,活性氧水平逐漸下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。使用DKK-1干預(yù)后,DCFH熒光顯示Fe+DFO+DKK-1組和Fe+DFO組活性氧水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);Westernblot顯示OPG及Axin2蛋白表達(dá)水平Fe+DFO+DKK-1組低于Fe+DFO組;茜素紅染色及鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)顯示Fe+DFO+DKK-1組少于Fe+DFO組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:在含鐵環(huán)境中,原代成骨細(xì)胞成骨生物學(xué)活性抑制、骨相關(guān)基因的表達(dá)降低,原因可能與ROS增加、Wnt通路改變相關(guān);DFO干預(yù)可有效抑制ROS增加,恢復(fù)原代成骨細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R580

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本文編號(hào)：1153356