發(fā)布時(shí)間：2017-11-07 11:14

  本文關(guān)鍵詞：黃芩中小分子化合物對(duì)雌激素缺乏骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療作用的研究

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【摘要】：[研究背景]骨質(zhì)疏松是一種全身代謝性的骨骼疾病,表現(xiàn)為骨量減少、骨小梁喪失、骨皮質(zhì)變薄、骨的微觀結(jié)構(gòu)遭到破壞,從而導(dǎo)致骨脆性增加,骨折發(fā)生率增高[1]。目前,全球已有超過2億人口被骨質(zhì)疏松疾病所困擾。骨質(zhì)疏松分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種,原發(fā)性所占比例較高,高達(dá)85%-90%,又可以分為女性絕經(jīng)后由雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松,以及年齡相關(guān)性的骨質(zhì)疏松;而繼發(fā)性骨質(zhì)疏松是由一些內(nèi)分泌性疾病和肝腎疾病等所導(dǎo)致的[2]�？傮w來說骨質(zhì)疏松更易發(fā)生在絕經(jīng)之后雌激素分泌減少的婦女[3]。骨質(zhì)疏松會(huì)隨著病程表現(xiàn)出一系列臨床癥狀如疼痛、骨長度的減少、骨折、呼吸功能的減低等等。以往臨床上常用來治療骨質(zhì)疏松的藥物主要是雌激素替代物、二磷酸鹽、甲狀旁腺素片段、降鈣素、鈣制劑和維生素D,而前四種藥物不同程度地存在副作用,比如引起乳腺腫瘤、骨壞死、心血管疾病等,后兩種藥物必須同時(shí)運(yùn)用,而且藥效有限[4]。因此,目前亟需一種安全、有效的骨質(zhì)疏松治療方法[5]。中醫(yī)文化博大精深,人們也一直在探索嘗試用中藥來治療骨質(zhì)疏松,因其更強(qiáng)調(diào)一個(gè)整體的概念,能夠調(diào)動(dòng)內(nèi)因,而作用于機(jī)體相關(guān)聯(lián)的多個(gè)環(huán)節(jié)。已有研究表明,中藥治療骨質(zhì)疏松的核心在于其中所含的天然多糖成分[6]。黃芩是一種在中國運(yùn)用歷史已久的傳統(tǒng)中藥,含有豐富的黃酮類化合物,研究較多的有黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等等[7],以往關(guān)于黃芩藥理的研究主要集中在抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化以及心血管保護(hù)等活性上,而對(duì)于抗骨質(zhì)疏松方面的相關(guān)研究較少。[研究目的]在大鼠去勢骨質(zhì)疏松模型中,探索黃芩提取物腹腔注射能否預(yù)防骨質(zhì)疏松的發(fā)生,能否減緩/逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松中的骨喪失,并進(jìn)一步探索黃芩提取物對(duì)bmmscs的影響。[研究方法]1.黃芩小分子化合物的分離提取。從干燥的黃芩根莖中依次用95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯萃取,冷凍干燥后過篩得到80目細(xì)粉。2.黃芩提取物中黃酮類化合物含量測定。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,估算黃酮類含量的百分比。3.黃芩提取物穩(wěn)定性測試。采用色譜分析法,將黃芩提取物溶液在80℃條件下加熱,檢測其在2小時(shí)內(nèi)的熱穩(wěn)定性;將黃芩提取物溶液在3個(gè)月內(nèi)的間隔時(shí)間節(jié)點(diǎn)加熱,檢測其在3個(gè)月內(nèi)的加速穩(wěn)定性。4.黃芩提取物眼及皮膚刺激性測試。以新西蘭白兔為受試對(duì)象,以一定濃度的黃芩提取物的丁二醇溶液滴眼,對(duì)側(cè)眼為自身空白對(duì)照,按照眼損害的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分后評(píng)估其眼刺激性。以一定濃度的黃芩提取物的丁二醇溶液涂抹皮膚,按皮膚刺激反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分后評(píng)估其皮膚刺激性。5.黃芩提取物毒性測試。以小鼠為受試對(duì)象,將一定劑量黃芩提取物予以灌胃。觀察動(dòng)物的中毒表現(xiàn)和死亡情況,按照經(jīng)口毒性分級(jí)評(píng)價(jià)其毒性。6.黃芩提取物對(duì)大鼠雌激素缺乏骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療作用。篩選適宜的濃度后,在雌性大鼠去勢骨質(zhì)疏松模型中,預(yù)防組從去勢后1周內(nèi)開始給予腹腔注射,治療組從去勢2月后開始腹腔注射。頻率為2次/周,周期共計(jì)12周,分別在第6和12周末microct掃描一側(cè)股骨,比較骨量和骨小梁數(shù)目差異,評(píng)價(jià)黃芩提取物對(duì)骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療作用。7.黃芩提取物對(duì)bmmscs的作用。培養(yǎng)各組大鼠的bmmscs,比較其增殖和分化能力的不同;向培養(yǎng)液中加入一定濃度黃芩提取物,檢測其對(duì)bmmscs增殖和成骨分化的影響。[研究結(jié)果]1.黃芩提取物是一種黃色有特殊氣味的固體粉末,可溶于丙二醇、丁二醇等有機(jī)溶劑,易溶于二甲基亞砜。2.黃芩提取物中黃酮類化合物含量較豐富,約為10%。3.黃芩提取物穩(wěn)定性較好,可承受80℃高溫達(dá)2h,并在3個(gè)月內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。4.黃芩提取物250mg/ml濃度滴眼后1h個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)輕微充血,但在24h、48h和72h,未見分泌物及水腫等現(xiàn)象,角結(jié)膜無異常,其無眼刺激性。以25mg/ml多次涂抹皮膚刺激后,有輕微紅斑,無水腫,其無皮膚刺激性。5.將黃芩提取物以5000mg/kg劑量灌胃之后24h內(nèi)死亡一只動(dòng)物,死亡率為10%,在安全范圍內(nèi);其余存活動(dòng)物精神狀態(tài)較好、行為無異常,且體重正常增長,表明其安全無毒性。6.黃芩提取物腹腔注射后,Micro CT結(jié)果顯示預(yù)防和治療組的給藥動(dòng)物骨量和骨小梁數(shù)目相比對(duì)照組都有所增加,但只是一定程度上減緩骨喪失、部分恢復(fù)骨量。7.以黃芩提取物刺激BMMSCs后MTT曲線和克隆形成率均顯示其對(duì)BMMSCs的增殖有促進(jìn)作用,成骨誘導(dǎo)后ALP染色和茜素紅染色顯示SGB-E刺激后ALP含量增加,礦化結(jié)節(jié)形成也較多,同時(shí)成骨相關(guān)基因表達(dá)增多,其對(duì)BMMSCs的成骨分化也有促進(jìn)作用。[研究結(jié)論]本研究從傳統(tǒng)中藥黃芩的根莖中通過浸提、萃取、濃縮的方法提取了黃酮含量較高的小分子化合物,將其用于預(yù)防和治療大鼠去勢所致的骨質(zhì)疏松,可以一定程度減緩骨流失并部分恢復(fù)骨量,同時(shí)在體外可以促進(jìn)BMMSCs的增殖和成骨分化。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步開發(fā)黃芩的藥用價(jià)值提供了一定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),并為利用黃芩開發(fā)出安全高效的預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的新藥奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R580

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