本文關(guān)鍵詞：高糖誘導(dǎo)miR-9抑制IL-33表達的功能機制

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【摘要】：炎癥反應(yīng)對于皮膚傷口愈合過程至關(guān)重要。適度的炎癥反應(yīng)有利于促進正常傷口愈合,抵抗微生物感染,維持機體平衡,然而炎癥反應(yīng)過度就會適得其反,造成傷口愈合困難。過度炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致一些慢性皮膚傷口如糖尿病皮膚傷口難愈合的主要原因之一。然而糖尿病高糖環(huán)境是如何導(dǎo)致炎癥應(yīng)答失調(diào),目前尚無報道。我們及其他課題組的研究結(jié)果都表明：在糖尿病傷口中IL-33低表達并且伴隨著TLR3依賴的前炎癥因子TNF-a和IL-6的高表達。然而對于IL-33在糖尿病中低表達的機制目前卻無報道,糖尿病中IL-33的低表達是否與糖尿病傷口過度炎癥有關(guān)也不清楚。本研究首先用高糖和IL-17或TLR3配體poly(I:C)共刺激角質(zhì)形成細胞后,發(fā)現(xiàn)高糖可以很明顯地抑制IL-17或poly(I:C)誘導(dǎo)的IL-33的表達,并且顯著促進poly(I:C)誘導(dǎo)的前炎癥因子IL-1p和IL-6的表達。我們進一步通過雙熒光素酶報告實驗篩選發(fā)現(xiàn)miR-9可以靶向IL-33 mRNA的3'UTR區(qū)抑制IL-33 mRNA的表達從而導(dǎo)致IL-33表達降低,并且在角質(zhì)形成細胞中,使用miR-9的抑制劑抑制miR-9后,高糖抑制IL-17誘導(dǎo)IL-33的表達得到明顯回復(fù)。此外,在角質(zhì)形成細胞中,高糖能明顯地誘導(dǎo)miR-9的表達。通過進一步研究我們發(fā)現(xiàn)高糖是通過NF-κB p65信號通路激活miR-9啟動子而上調(diào)miR-9的表達。這些實驗結(jié)果說明高糖通過激活NF-κB p65誘導(dǎo)miR-9的表達來抑制IL-33的表達。另一方面,我們也探討了IL-33抑制炎癥的功能機制。通過使用純化的重組IL-33和poly(I:C)共刺激角質(zhì)形成細胞,我們發(fā)現(xiàn)IL-33能很明顯地使JNK2去磷酸化而抑制poly(I:C)誘導(dǎo)的前炎癥因子TNF-α、IL-1β口IL-6的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)在角質(zhì)形成細胞中IL-33可以明顯地誘導(dǎo)負調(diào)節(jié)子SHP-1的表達,并且通過免疫共沉淀實驗我們證明了SHP-1通過其磷酸酶位點與JNK2磷酸化位點結(jié)合使JNK2去磷酸化而失活。因此,我們認為IL-33是通過誘導(dǎo)SHP-1的表達使JNK2去磷酸化失活而抑制了TLR3依賴的炎癥的發(fā)生。綜上所述,本研究以糖尿病中IL-33低表達為切入點,首次從miRNA角度闡述了糖尿病患者皮膚傷口部位IL-33低表達機制,并且研究了高糖誘導(dǎo)miR-9表達機制及IL-33抑制炎癥的功能機制。這些研究結(jié)果為解決糖尿病患者體內(nèi)高糖環(huán)境是如何導(dǎo)致皮膚傷口過度炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生而使傷口難愈合的問題提供新的研究思路與治療靶點。
【關(guān)鍵詞】：白介素33 miR-9 SHP-1 糖尿病 炎癥
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 綜述13-29
• 1 糖尿病皮膚傷口炎癥反應(yīng)13-17
• 1.1 糖尿病皮膚傷口愈合13-15
• 1.2 糖尿病傷口炎癥反應(yīng)15-17
• 2 白介素33(IL-33)在糖尿病炎癥應(yīng)答中的生物學功能17-21
• 2.1 IL-33及受體ST217-18
• 2.2 IL-33調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答的作用機理18-20
• 2.3 糖尿病中IL-33的表達調(diào)節(jié)20-21
• 3 microRNA在糖尿病炎癥應(yīng)答中的生物學功能21-26
• 3.1 microRNA的加工成熟過程21-22
• 3.2 microRNA的靶基因預(yù)測22-23
• 3.3 microRNA的表達調(diào)節(jié)23
• 3.4 microRNA對靶基因表達調(diào)控的機制23-24
• 3.5 microRNA在糖尿病炎癥應(yīng)答中的功能24-26
• 4 酪氨酸磷酸酶SHP-1在糖尿病炎癥應(yīng)答中的生物學功能26-29
• 4.1 酪氨酸磷酸酶SHP-126
• 4.2 SHP-1調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答的機制26-27
• 4.3 糖尿病中SHP-1的調(diào)節(jié)表達27-29
• 第二章 高糖誘導(dǎo)miR-9抑制IL-33表達的功能機制29-74
• 一 引言29-30
• 二 實驗材料30-35
• 1 細胞、菌株及質(zhì)粒30-31
• 2 實驗試劑31-32
• 2.1 分子生物學實驗試劑31
• 2.2 細胞培養(yǎng)試劑31-32
• 2.3 細菌培養(yǎng)試劑32
• 2.4 其他細胞實驗試劑32
• 3 實驗儀器與耗材32
• 4 引物32-35
• 4.1 實時熒光定量PCR引物序列32-33
• 4.2 克隆引物序列33-35
• 5 抗體35
• 三 實驗方法35-46
• 1 細胞培養(yǎng)35-36
• 1.1 HEK、HaCaT和HEK-293T/17復(fù)蘇35-36
• 1.2 HEK、HaCaT和HEK-293T/17傳代36
• 1.3 HEK、HaCaT和HEK-293T/17凍存36
• 2 細菌培養(yǎng)36
• 2.1 LB培養(yǎng)基配制36
• 2.2 大腸桿菌DH5α培養(yǎng)36
• 3 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR36-38
• 3.1 總RNA提取36-37
• 3.2 RNA反轉(zhuǎn)錄37-38
• 3.3 實時定量PCR38
• 4 蛋白質(zhì)提取、樣品制備和免疫印跡(western blot)38-42
• 4.1 蛋白質(zhì)提取和樣品制備38-39
• 4.2 蛋白質(zhì)免疫印跡39-42
• 5 蛋白免疫共沉淀(Co-IP)42
• 6 定點突變或缺失質(zhì)粒構(gòu)建42-43
• 7 細胞轉(zhuǎn)染43-44
• 7.1 脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染43
• 7.2 脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染43-44
• 7.3 磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染44
• 8 microRNA的檢測與克隆44-45
• 8.1 microRNA的檢測44-45
• 8.2 microRNA的克隆45
• 9 雙熒光素酶報告實驗45
• 10 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析45-46
• 四 實驗結(jié)果與分析46-72
• 1 糖尿病小鼠皮膚傷口IL-33低表達46-47
• 2 糖尿病小鼠皮膚傷口炎癥因子高表達47-48
• 3 高糖促進TLR3依賴的炎癥因子的表達48-49
• 4 IL-33抑制TLR3依賴的炎癥因子的表達49-51
• 5 高糖抑制poly(I：C)或IL-17誘導(dǎo)的IL-33的表達51-53
• 6 高糖通過激活NF-κB誘導(dǎo)miR-9抑制IL-33的表達53-64
• 6.1 高糖抑制IL-33 mRNA的表達53-54
• 6.2 高糖誘導(dǎo)miR-9的表達54-56
• 6.3 高糖誘導(dǎo)miR-9靶向IL-33 mRNA 3'UTR抑制IL-33的表達56-60
• 6.4 高糖不調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1/4和Dicer酶的表達60-61
• 6.5 高糖不誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα/β、VDR和GATA-1的表達61-62
• 6.6 高糖通過激活NF-κB誘導(dǎo)miR-9的表達62-64
• 7 IL-33誘導(dǎo)SHP-1表達抑制poly(I：C)誘導(dǎo)的JNK2的磷酸化64-72
• 7.1 IL-33抑制poly(I：C)誘導(dǎo)的JNK2的磷酸化64-65
• 7.2 IL-33誘導(dǎo)負調(diào)節(jié)子SHP-1的表達65-66
• 7.3 SHP-1與JNK相互結(jié)合66-67
• 7.4 JNK2與SHP-1磷酸酶活性位點結(jié)合67-69
• 7.5 SHP-1與JNK2磷酸化位點結(jié)合69-72
• 五 討論72-74
• 第三章 總結(jié)74-76
• 參考文獻76-86
• 附錄86-87
• 碩士期間研究成果87

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本文編號：1116689