本文關(guān)鍵詞：百草枯殘留檢測(cè)ELISA試劑盒及百草枯模擬抗體的解毒效果研究

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【摘要】：背景百草枯是時(shí)下世界上應(yīng)用最多的除草劑,對(duì)人和動(dòng)物均有較強(qiáng)毒性。百草枯中毒在臨床中的死亡率極高,目前尚無(wú)明顯有效的救治方法。百草枯中毒的病死率與口服百草枯的量有密切關(guān)系,一般認(rèn)為口服20%百草枯水劑20 mg/kg即可導(dǎo)致死亡。目前我國(guó)多采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、紫外分光光度法、毛細(xì)血管電泳法、高效液相色譜法等進(jìn)行檢測(cè),但這些檢測(cè)方法均需要復(fù)雜的樣品前處理,在前處理過(guò)程中會(huì)丟失部分百草枯,造成檢驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確,且不同樣品的百草枯殘留有各自最佳的檢測(cè)方法,不僅加大了檢測(cè)難度還增加了檢測(cè)費(fèi)用,因此需要建立一種高效、可靠、簡(jiǎn)便的百草枯殘留檢測(cè)方法,指導(dǎo)臨床治療和判斷預(yù)后。百草枯進(jìn)入人體后通過(guò)炎癥反應(yīng)、氧化損傷等導(dǎo)致各個(gè)器官均受損害,其中嚴(yán)重肺纖維化所致的呼吸衰竭是百草枯中毒最主要的死亡原因,因此減緩肺纖維化的進(jìn)程,降低死亡率,是百草枯中毒治療的關(guān)鍵。目前臨床上首選的治療方法為血液凈化,但血液凈化費(fèi)用昂貴,且研究發(fā)現(xiàn)血液凈化雖然能夠延長(zhǎng)生存時(shí)間,但對(duì)降低病死率的作用不大。所以百草枯中毒的治療方法一直是臨床上的難題,建立規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)、有效的治療方案是急需解決的問(wèn)題。目的研制一種前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高,且能同時(shí)檢測(cè)食物、血液、尿液以及胃液中百草枯殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒,以滿(mǎn)足農(nóng)業(yè)及臨床上的快速檢測(cè)需求;驗(yàn)證百草枯模擬抗體對(duì)百草枯所致急性肺損傷的解毒效果,探討臨床應(yīng)用的可行性。方法1.本實(shí)驗(yàn)利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法來(lái)檢測(cè)百草枯的殘留。首先合成百草枯完全抗原(PQ-OVA)作為包被原,然后加入目標(biāo)物與固定抗原共同競(jìng)爭(zhēng)抗百草枯抗體,最后加入酶標(biāo)二抗,顯色并終止后讀取OD450值,利用百草枯抗體與百草枯小分子的高度專(zhuān)一性來(lái)推算目標(biāo)物中小分子的含量。本研究通過(guò)優(yōu)化ELISA的各種相關(guān)條件提高檢測(cè)靈敏度,具體優(yōu)化內(nèi)容包括:⑴包被原及抗百草枯抗體濃度。⑵包被時(shí)間,包被孵育溫度。⑶選擇封閉液的種類(lèi)、濃度,封閉量和封閉時(shí)間。(4)一抗稀釋液的篩選。(5)競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間。(6)二抗稀釋液的選擇。(7)酶標(biāo)二抗的濃度及酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間。(8)底物a與b的比例。(9)底物顯色時(shí)間。(10)抗體穩(wěn)定劑的選擇。按照優(yōu)化好的條件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,選擇白菜、玉米、大豆、血液、尿液、胃液作為樣品,確定試劑盒的加標(biāo)回收率及變異系數(shù),驗(yàn)證試劑盒的靈敏度、穩(wěn)定性、特異性等。最后對(duì)抗體及試劑盒的有效期進(jìn)行檢測(cè),確保滿(mǎn)足試劑盒的應(yīng)用要求。2.同時(shí)建立百草枯中毒大鼠模型,觀察抗百草枯模擬抗體對(duì)百草枯所致的急性肺損傷的解毒作用。首先純化抗百草枯模擬抗體,確保其能夠特異性識(shí)別百草枯小分子。然后建立百草枯中毒大鼠模型,選取6~8周的spf級(jí)大鼠65只,體質(zhì)量200~250g,隨機(jī)分為3組,其中對(duì)照組15只,染毒組25只,治療組25只,正常飼養(yǎng)條件。對(duì)照組腹腔注射無(wú)菌生理鹽水(ns)1.8ml/kg;染毒組腹腔注射20%百草枯水劑18mg/kg,20%百草枯水劑用無(wú)菌生理鹽水稀釋至10mg/ml后再注射;治療組(pq抗體組)在pq中毒2h后立即尾靜脈注射抗pq模擬抗體(1mg/kg),連續(xù)注射等劑量抗體3天。連續(xù)14天觀察各組大鼠的表現(xiàn)和反應(yīng),并分別于1、3、7、14天時(shí)處死3只大鼠,采血離心檢測(cè)tgf-β1和il-6的表達(dá)水平,并取左下肺葉于10%甲醛液浸泡后石蠟包埋,做成4μm厚的切片,蘇木精-伊紅染色(h-e染色)后行顯微鏡觀察病理變化,對(duì)比三組的不同點(diǎn)。結(jié)果1.間接競(jìng)爭(zhēng)elisa最佳反應(yīng)條件如下:包被抗原和一抗工作濃度分別為2.0μg/ml和1:28000;包被溫度和時(shí)間為4℃14h;封閉液為1%ova;封閉量為150μl;封閉時(shí)間為45min;競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)時(shí)間為45min,二抗作用時(shí)間為30min,酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?:4000;顯色液比例為a/b=1/19;顯色時(shí)間10min。2.試劑盒的最低檢測(cè)限即ic10為0.08ng/ml,線性檢測(cè)范圍為0.16~10.76ng/ml,ic50為1.32ng/ml。該試劑盒與敵草快的交叉反應(yīng)率僅為0.01348%.各種樣品添加回收率均高于80%,變異系數(shù)小于14%,板內(nèi)變異系數(shù)在0.24%~9.57%之間,板間變異系數(shù)在1.17%~11.09%之間,結(jié)果表明該elisa法同國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法相比,其檢測(cè)靈敏度更高。3.百草枯模擬抗體成功表達(dá),經(jīng)間接競(jìng)爭(zhēng)elisa驗(yàn)證,其具有良好的競(jìng)爭(zhēng)活性。以18mg/kg的劑量成功建立了百草枯中毒模型,同時(shí)用百草枯模擬抗體解毒。中毒組顯微鏡觀察顯示,大鼠肺組織的損傷隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加而日益加重,成批的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺纖維化逐日形成。而治療組肺組織炎癥減輕,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)明顯纖維化。中毒組tgf-β1和il-6水平隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,而治療組在注射百草枯模擬抗體后TGF-β1和IL-6水平呈下降趨勢(shì)。結(jié)論1.研制的百草枯殘留檢測(cè)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒可同時(shí)對(duì)食物、血液、尿液以及胃液進(jìn)行檢測(cè),靈敏度高、特異性佳,樣品前處理簡(jiǎn)單,添加回收率高,變異率低,完全可滿(mǎn)足檢測(cè)需求。2.百草枯模擬抗體能抑制TGF-β1和IL-6的分泌,減輕百草枯中毒所致的肺損傷,并可在一定程度上阻止發(fā)展為肺纖維化。
【關(guān)鍵詞】：百草枯 ELISA 試劑盒 百草枯模擬抗體 急性肺損傷
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R595.4
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-17
• 百草枯殘留檢測(cè)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒的研制17-47
• 1.實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器17-18
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料17
• 1.2 主要試劑17
• 1.3 主要儀器17-18
• 1.4 ELISA相關(guān)溶液的配制18
• 2.實(shí)驗(yàn)方法18-27
• 2.1 百草枯完全抗原的合成18-21
• 2.2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的優(yōu)化21-25
• 2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制25
• 2.4 方法特異性實(shí)驗(yàn)25
• 2.5 樣品的實(shí)際檢測(cè)25-26
• 2.6 準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定26
• 2.7 試劑盒的穩(wěn)定性26-27
• 3. 結(jié)果27-47
• 3.1PQ-OVA的合成結(jié)果27-29
• 3.2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的優(yōu)化結(jié)果29-41
• 3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立41-43
• 3.4 方法特異性實(shí)驗(yàn)43
• 3.5 實(shí)際樣品的加標(biāo)檢測(cè)43-44
• 3.6 準(zhǔn)確度和精密度44
• 3.7 試劑盒的穩(wěn)定性44-47
• 百草枯模擬抗體治療百草枯急性肺損傷的研究47-59
• 1.實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器47-48
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料47
• 1.2 主要試劑47
• 1.3 主要儀器47-48
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法48-51
• 2.1 抗PQ模擬抗體菌株的誘導(dǎo)表達(dá)48
• 2.2 百草枯模擬抗體的純化48-49
• 2.3 抗PQ抗體的性質(zhì)鑒定49-50
• 2.4 百草枯中毒模型的建立50
• 2.5 細(xì)胞因子的檢測(cè)50-51
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-59
• 3.1 百草枯模擬抗體的誘導(dǎo)表達(dá)51-52
• 3.2 百草枯模擬抗體的純化52
• 3.3 百草枯模擬抗體的性質(zhì)鑒定52-53
• 3.4 百草枯中毒模型的建立53-56
• 3.5 細(xì)胞因子的檢測(cè)56-59
• 討論59-63
• 結(jié)論63-65
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 綜述69-79
• 參考文獻(xiàn)75-79
• 致謝79-81
• 研究生期間發(fā)表的論文81-82

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