發(fā)布時間：2017-10-27 02:14

  本文關(guān)鍵詞：胰島素信號對不同基因型小鼠ADSCs成脂后去分化的影響

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【摘要】：迄今為止的國內(nèi)外研究表明,從動物體內(nèi)分離得到的內(nèi)臟或皮下白色成熟脂肪細(xì)胞在無外源胰島素的體外培養(yǎng)條件下,可自主發(fā)生去分化;而添加胰島素則可維持其原有成熟表型、抑制其去分化。我推測胰島素信號與脂肪細(xì)胞去分化存在相關(guān)性。然而胰島素信號影響脂肪細(xì)胞去分化的分子機(jī)制尚不明了。本文采用形態(tài)學(xué)和分子細(xì)胞生物學(xué)檢測手段,通過研究胰島素信號對肥胖和非肥胖小鼠成脂細(xì)胞去分化的影響,進(jìn)而對不同遺傳背景小鼠的內(nèi)臟白色脂肪細(xì)胞去分化機(jī)制進(jìn)行初步探討。本文選用7-8周齡的四種基因型(C57BL/6J遺傳背景,WT、TNF-α-/-、Leprdb/db以及DT)雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)材料。前兩種小鼠為非肥胖小鼠,后兩種為遺傳性自發(fā)性肥胖小鼠。首先,使用經(jīng)典的“雞尾酒法”,分別誘導(dǎo)上述不同基因型小鼠內(nèi)臟原代白色脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)體外成脂分化為成熟脂肪細(xì)胞,然后,采用不同的方法處理細(xì)胞,令其去分化。共設(shè)三組:(1)單純對照組,成脂誘導(dǎo)后10天后去除胰島素,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的完全生長培養(yǎng)基中(含有未知的微量胰島素);(2)干預(yù)組,在去除胰島素的同時添加胰島素信號抑制劑(OSI-906,linstinib),細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的完全生長培養(yǎng)基中;(3)DMSO對照組,在去除胰島素的同時添加OSI-906的溶劑(DMSO),細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的完全生長培養(yǎng)基中。三組細(xì)胞去分化實(shí)驗(yàn)開始后,在相應(yīng)培養(yǎng)條件下,繼續(xù)培養(yǎng)8天。此外,為了驗(yàn)證去分化的成脂細(xì)胞(dedifferentiated fat cells,DFATCs)是否重新獲得干細(xì)胞特性,對其進(jìn)行了成脂再分化和成骨轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。通過一般形態(tài)學(xué)和特殊染色方法,以及針對脂解、成脂、胰島素信號通路和脂肪干細(xì)胞相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的檢測,探究胰島素信號對不同基因型小鼠成脂細(xì)胞去分化的影響。結(jié)果如下:1.分離純化WT小鼠ADSCs,以確定成脂分化、成脂后去分化以及DFATCs成脂再分化的檢測時期。通過細(xì)胞形態(tài)變化特征確定了以下五個時期:成脂分化0天(D0)、10天(D10),成脂后去分化3天(DD3)、8天(DD8),DFATCs成脂再分化10天(RD10)。2.選用不同濃度(0、0.1、0.3和1μM)的胰島素信號通路抑制劑(OSI-906)干預(yù)WT ADSCs成脂分化。通過細(xì)胞形態(tài)變化特征和靶蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果,確定了在胰島素和血清均存在的條件下完全抑制胰島素信號通路的最小藥物(OSI-906)濃度。結(jié)果表明0.3μm最佳。3.形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果:(1)adscs成脂誘導(dǎo)10天后成功分化為成熟脂肪細(xì)胞;(2)成熟脂肪細(xì)胞隨著去分化時間的延長逐漸發(fā)生去分化,dd8時完成去分化;(3)去分化速率為:干預(yù)組對照組,單純對照組≈dmso對照組;(4)干預(yù)組和對照組的dfatcs成脂誘導(dǎo)10天后,再分化為成熟脂肪細(xì)胞,兩組之間的成脂率無顯著差異;(5)wt、tnf-α-/-、leprdb/db以及dt小鼠adscs的形態(tài)變化特征差異不大。4.wt、tnf-α-/-、leprdb/db以及dt小鼠的對照組和干預(yù)組dfatcs獲得前后的脂肪干細(xì)胞標(biāo)志cd105表達(dá)持續(xù)上升;wtdfatcs成骨誘導(dǎo)21天后,茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色結(jié)果為陽性,表明dfatcs重新獲得干細(xì)胞特性。5.實(shí)時熒光定量rt-pcr(qpcr)檢測結(jié)果顯示:在小鼠成脂細(xì)胞去分化過程(dd0至dd8)中,胰島素信號通路關(guān)鍵因子akt、glut-4的mrna表達(dá)水平無顯著變化;成脂相關(guān)因子c/ebpα、pparγ、adiponectin和srebp-1的mrna表達(dá)水平持續(xù)下降;脂解關(guān)鍵因子atgl的mrna表達(dá)水平呈先升高后下降的趨勢。單純對照組、dmso對照組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),兩個對照組之間無顯著差異。與對照組相比,osi-906干預(yù)組的atgl的mrna表達(dá)水平上調(diào),c/ebpα、pparγ、adiponectin和srebp-1的mrna表達(dá)水平下調(diào)。另外,wt、tnf-α-/-、leprdb/db以及dt小鼠adscs的各檢測分子在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化趨勢一致,主要差異在于各檢測分子(同一時期和同一組)的相對表達(dá)量有所不同。6.westernblotting結(jié)果顯示:在adscs成脂后去分化過程中(dd0至dd8),p-akt(thr308)的蛋白激活水平大幅下降,glut-4的蛋白表達(dá)水平呈先上升后下降的變化趨勢,srebp-1和adiponectin的蛋白表達(dá)水平在去分化早期(dd3)已下降至檢測極限。比較三組結(jié)果發(fā)現(xiàn),單純對照組和dmso對照組間無顯著差異,osi-906干預(yù)組的p-akt(thr308)的蛋白激活水平極顯著低于對照組。另外,wt、tnf-α-/-、leprdb/db以及dt小鼠adscs的各檢測分子在基因翻譯水平的表達(dá)變化趨勢一致,主要差異在于各檢測分子(同一時期和同一組)的相對表達(dá)量有所不同。綜上所述,胰島素信號缺失對肥胖(leprdb/db、dt)和非肥胖(wt、tnf-α-/-)小鼠成脂細(xì)胞去分化起到促進(jìn)作用,即胰島素信號缺失在成脂細(xì)胞中抑制srebp-1、pparγ和c/ebpα表達(dá)的同時,促進(jìn)了脂解關(guān)鍵分子和脂肪干細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá),從而促進(jìn)成脂細(xì)胞去分化的發(fā)生。此外,胰島素信號缺失對小鼠成脂細(xì)胞去分化的促進(jìn)作用與小鼠基因型及肥胖程度關(guān)系不大。
【關(guān)鍵詞】：成脂細(xì)胞去分化 胰島素信號通路 DFATCs OSI-906
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R589.2
【目錄】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-23
• 1 ADSCs的來源及其多分化潛能12-13
• 2 脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控因素13-17
• 3 胰島素信號通路與成脂分化17-20
• 4 成熟脂肪細(xì)胞去分化的相關(guān)研究20-22
• 5 本研究的目的及意義22-23
• 第二章 小鼠ADSCs的鑒定23-40
• 1 前言23
• 2 材料與方法23-36
• 3 結(jié)果36-39
• 4 討論39-40
• 第三章 小鼠ADSCs成脂分化、去分化及再分化檢測時期確定40-45
• 1 前言40
• 2 材料與方法40-42
• 3 結(jié)果42-44
• 4 討論44-45
• 第四章 胰島素信號抑制劑的濃度選擇45-54
• 1 前言45
• 2 材料與方法45-52
• 3 結(jié)果52-53
• 4 討論53-54
• 第五章 胰島素信號對不同基因型小鼠ADSCs成脂細(xì)胞去分化的形態(tài)影響54-61
• 1 前言54
• 2 材料與方法54-56
• 3 結(jié)果56-60
• 4 討論60-61
• 第六章 小鼠DFATCs的鑒定及成骨轉(zhuǎn)分化61-65
• 1 前言61
• 2 材料與方法61-63
• 3 結(jié)果63-64
• 4 討論64-65
• 第七章 胰島素信號對不同基因型小鼠ADSCs成脂細(xì)胞去分化的靶基因表達(dá)影響65-72
• 1 前言65
• 2 材料與方法65-67
• 3 結(jié)果67-71
• 4 討論71-72
• 第八章 胰島素信號對不同基因型小鼠ADSCs成脂細(xì)胞去分化的靶蛋白表達(dá)影響72-81
• 1 前言72
• 2 材料與方法72-76
• 3 結(jié)果76-80
• 4 討論80-81
• 討論與總結(jié)81-84
• 參考文獻(xiàn)84-90
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文90-91
• 致謝91

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本文編號：1101477