本文關(guān)鍵詞：IL-6調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血淋巴細(xì)胞P-糖蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究

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【摘要】：背景:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是高度致殘性自身免疫性疾病,目前RA治療領(lǐng)域中的最大挑戰(zhàn)是改善病情抗風(fēng)濕藥(Disease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs)多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)的產(chǎn)生。ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所介導(dǎo)的藥物排出增加可能是多藥耐藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制,其中最典型的藥物排出機(jī)制即多藥耐藥基因1(MDR1)及其編碼的細(xì)胞膜表面P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表達(dá)增加。本課題為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)逆轉(zhuǎn)耐藥研究的系列研究之一,我們的前期研究證實(shí):1.RA患者外周血淋巴細(xì)胞P-gp的表達(dá)水平明顯增加,且與炎性指標(biāo)(血沉、C-反應(yīng)蛋白)及疾病活動(dòng)度(DAS28)相關(guān),說明其參與了多藥耐藥的形成。2.不同治療組P-gp表達(dá)水平的比較中,聯(lián)合用藥較單用藥P-gp表達(dá)水平減少,表明MTX/LFE周期聯(lián)合CTX一定程度逆轉(zhuǎn)P-gp表達(dá)。3.IL-6刺激后,RA外周血淋巴細(xì)胞中P-gp的表達(dá)和功能均增強(qiáng),且具有一定的時(shí)間依賴性及濃度依賴性。P-gp的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜,其中,細(xì)胞因子的角色愈發(fā)受到重視。白介素-6(Interleukin-6,IL-6)作為一種多效應(yīng)細(xì)胞因子,參與RA的全部致病過程。本課題前期研究已證明:1.RA患者外周血淋巴細(xì)胞上P-gp的表達(dá)水平明顯增加,且與炎性指標(biāo)(血沉、C-反應(yīng)蛋白)及疾病的活動(dòng)度(DAS28)相關(guān)。2.IL-6刺激后,RA患者外周血淋巴細(xì)胞上P-gp的表達(dá)和功能均增強(qiáng),且具有一定的時(shí)間及濃度依賴性。那么,IL-6具體如何調(diào)控P-gp的表達(dá),其具體信號通路是什么?是本課題的科學(xué)問題。細(xì)胞因子對細(xì)胞的調(diào)控作用主要通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來介導(dǎo)。眾多研究表明,細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中的角色愈發(fā)重要,其關(guān)鍵酶的特異性抑制劑也成為最有前途的靶向治療藥物之一。本課題即從研究較多的mapk途徑和jak-stat途徑入手,探究il-6調(diào)控ra患者外周血淋巴細(xì)胞p-gp的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,以明確il-6對ra患者外周血淋巴細(xì)胞p-gp的具體調(diào)控機(jī)制。目的:通過不同細(xì)胞通路抑制劑預(yù)處理后,加入il-6共培養(yǎng)72h,觀察各組外周血淋巴細(xì)胞的mrna合成水平、膜表面蛋白水平及其功能,明確炎癥細(xì)胞因子il-6調(diào)控ra患者外周血淋巴細(xì)胞p-gp的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。方法:選取初治ra患者20例,用肝素抗凝管采集外周血標(biāo)本20ml,提取外周血淋巴細(xì)胞,建立外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系,a組為空白對照組,在c、d組分別加入jak2-stat3通路抑制劑ag490(50um)、erk1/2通路抑制劑pd98059(20um)進(jìn)行預(yù)處理。處理30min后,b、c、d組均加入il-6,濃度2ng/ml,置于37℃c02培養(yǎng)箱中,飽和濕度下培養(yǎng),在72h收集細(xì)胞,rt-pcr的方法測外周血淋巴細(xì)胞p-gpmrna的合成,westernblot測定外周血淋巴細(xì)胞細(xì)胞膜上p-gp蛋白水平,羅丹明123蓄積實(shí)驗(yàn)檢測外周血淋巴細(xì)胞p-gp的功能。分析不同通路抑制劑對il-6調(diào)控ra外周血淋巴細(xì)胞p-gp的影響。結(jié)果:1、rt-pcr檢測各組外周血淋巴細(xì)胞p-gpmrna水平:與空白對照組相比,il-6組p-gpmrna表達(dá)水平明顯升高(p0.05);與il-6組相比,ag490預(yù)處理+il-6組與pd98059預(yù)處理+il-6組的p-gpmrna表達(dá)水平均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);空白對照組、ag490+il-6組、pd98059+il-6組兩兩比較組間無差異(p0.05)。2、Western Blot檢測各組外周血淋巴細(xì)胞p-gp蛋白水平:與空白對照組相比,IL-6組外周血淋巴細(xì)胞膜表面P-gp蛋白水平明顯升高(P0.05);與IL-6組相比,AG490預(yù)處理+IL-6組與PD98059預(yù)處理+IL-6組的外周血淋巴細(xì)胞膜表面P-gp蛋白水平均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);空白對照組、AG490+IL-6組、PD98059+IL-6組兩兩比較組間無差異(P0.05)。3、Rh123蓄積實(shí)驗(yàn)檢測各組外周血淋巴細(xì)胞P-gp的功能:與空白對照組相比,IL-6組Rh123蓄積量明顯減少,說明P-gp功能增強(qiáng)(P0.05);與IL-6組相比,AG490預(yù)處理+IL-6組與PD98059預(yù)處理+IL-6組的Rh123蓄積量均增加,說明P-gp功能減弱,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);空白對照組、AG490+IL-6組、PD98059+IL-6組兩兩比較組間無差異(P0.05)。結(jié)論:1、炎性細(xì)胞因子IL-6刺激后,RA外周血淋巴細(xì)胞耐藥膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp mRNA合成水平、蛋白表達(dá)水平及功能均明顯增強(qiáng)。2、ERKl/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑PD98059及JAK2-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑AG490二者均可抑制IL-6誘導(dǎo)的RA外周血淋巴細(xì)胞P-gp mRNA合成水平、蛋白水平及功能的增強(qiáng)。3、ERKl/2、JAK2-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與IL-6對RA外周血淋巴細(xì)胞P-gp的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 外周血淋巴細(xì)胞 P-糖蛋白 多藥耐藥性 白介素-6 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 技術(shù)路線圖15-16
• 1 材料與方法16-26
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料16-18
• 1.2 研究方法18-25
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析25-26
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-31
• 2.1 RT-PCR檢測各組外周血淋巴細(xì)胞P-gp mRNA水平26-27
• 2.2 Western Blot檢測各組外周血淋巴細(xì)胞P-gp蛋白水平27-28
• 2.3 Rh123蓄積實(shí)驗(yàn)檢測各組外周血淋巴細(xì)胞P-gp的功能28-31
• 3 討論31-35
• 3.1 P-gp與RA多藥耐藥的相關(guān)性研究31-32
• 3.2 RA中P-gp與IL-6 的相關(guān)性研究32
• 3.3 IL-6 對RA外周血淋巴細(xì)胞P-gp調(diào)控機(jī)制的研究32-34
• 3.4 展望34-35
• 4 結(jié)論35-36
• 本研究創(chuàng)新點(diǎn)36-37
• 參考文獻(xiàn)37-40
• 綜述40-49
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 在校期間參與研究課題及成果49-50
• 致謝50-52
• 個(gè)人簡歷52

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