本文關(guān)鍵詞：雌二醇通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)大鼠BMSCs成骨分化機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 雌激素 經(jīng)典Wnt信號通路 成骨分化 骨質(zhì)疏松

【摘要】：目的:觀察不同濃度17β-雌二醇對大鼠BMSCs成骨分化的影響,并分析成骨分化過程中經(jīng)典Wnt信號通路相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)差異,探索17β-雌二醇通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)大鼠BMSCs成骨分化的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用雌激素或SERMs治療PMOP提供理論依據(jù)。方法:應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法分離4周齡雄性SD大鼠雙下肢的骨髓單個核細(xì)胞,通過多次換液及傳代時控制胰酶消化時間純化BMSCs;利用BMSCs的三個特性對其進(jìn)行鑒定,(1)貼壁特性;(2)多向分化潛能:對P2代細(xì)胞分別進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)并設(shè)空白對照,每3天全量換液,于成骨誘導(dǎo)第7天進(jìn)行ALP染色,成骨誘導(dǎo)第21天進(jìn)行Alizarin Red S染色,成脂誘導(dǎo)14天進(jìn)行Oil Red O染色,觀察其分化能力;(3)利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測:CD34、CD44、CD45、CD105。將鑒定成功的大鼠BMSCs接種于多個6孔板中,進(jìn)行分組培養(yǎng),分別為0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L組,待每孔細(xì)胞達(dá)到約80%融合,以相應(yīng)梯度濃度17β-雌二醇處理各組細(xì)胞,DMSO處理作為對照組,同時對各組進(jìn)行成骨誘導(dǎo),每3天全量換液,于成骨誘導(dǎo)第7天進(jìn)行ALP染色并進(jìn)行ALP定量分析,成骨誘導(dǎo)第7天分別提取各組細(xì)胞總蛋白,利用Western blot檢測各組細(xì)胞Wnt10b、β-catenin、LRP5表達(dá)量,成骨誘導(dǎo)第21天進(jìn)行Alizarin Red S染色。結(jié)果:利用全骨髓培養(yǎng)法分離出的大鼠骨髓中的單個核細(xì)胞形態(tài)良好,增殖能力強(qiáng);通過多次換液及傳代時控制胰酶消化時間可純化BMSCs,P2代細(xì)胞純度可達(dá)95%;對P2代細(xì)胞分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo),經(jīng)鑒定BMSCs可向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化;利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定P2代細(xì)胞,證實(shí)所得細(xì)胞為間充質(zhì)來源且均一性較高;對P2代細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的同時用梯度濃度(0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L)的17β-雌二醇進(jìn)行處理,成骨誘導(dǎo)7天后ALP染色及定量分析顯示,隨著17β-雌二醇濃度的增加,ALP表達(dá)量逐漸增加,且活性增強(qiáng),其中10-5 mol/L組活性最強(qiáng),各處理組與空白對照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;成骨誘導(dǎo)第7天,對各組目標(biāo)蛋白表達(dá)量進(jìn)行Western blot檢測顯示:Wnt10b、β-catenin表達(dá)量隨著17β-雌二醇濃度的增加而逐漸增加,10-5mol/L組最高,LRP5各組表達(dá)量無明顯差異;成骨誘導(dǎo)第21天Alizarin Red S染色結(jié)果顯示:各組紅褐色礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量亦隨著17β-雌二醇濃度的增高而逐漸增加。結(jié)論:通過全骨髓培養(yǎng)法可分離篩選出純度高、均一性好、增殖能力強(qiáng)的BMSCs;BMSCs在特定的誘導(dǎo)條件下可向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化,具有多向分化潛能;體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,雌激素可濃度依賴性的促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化,參與成骨細(xì)胞的分化成熟,并且此效應(yīng)可能是通過上調(diào)經(jīng)典Wnt信號通路中Wnt10b及β-catenin的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,而雌激素對經(jīng)典Wnt信號通路中膜受體LRP5的表達(dá)無明顯影響。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 雌激素 經(jīng)典Wnt信號通路 成骨分化 骨質(zhì)疏松
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R580
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-14
• 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 研究目的、方法12-14
• 一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定14-21
• 1.1 對象和方法14-18
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物14
• 1.1.2 儀器與試劑14-15
• 1.1.3 試劑配制15
• 1.1.4 實(shí)驗(yàn)方法15-18
• 1.2 結(jié)果18-19
• 1.2.1 原代培養(yǎng)18
• 1.2.2 傳代培養(yǎng)18
• 1.2.3 堿性磷酸酶染色18-19
• 1.2.4 茜素紅S染色19
• 1.2.5 油紅O染色19
• 1.2.6 細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定19
• 1.3 討論19-20
• 1.3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞19
• 1.3.2 分離方法19-20
• 1.3.3 BMSCs鑒定方法20
• 1.4 小結(jié)20-21
• 二、雌二醇通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化機(jī)制研究21-32
• 2.1 對象和方法21-27
• 2.1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞21
• 2.1.2 儀器與試劑21-22
• 2.1.3 試劑配制22-23
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)方法23-27
• 2.2 結(jié)果27-28
• 2.2.1 堿性磷酸酶染色及定量分析27-28
• 2.2.2 茜素紅染色28
• 2.2.3 Western blot28
• 2.3 討論28-31
• 2.3.1 雌二醇對BMSCs成骨分化的影響28-29
• 2.3.2 雌二醇對經(jīng)典Wnt信號通路的影響29-31
• 2.4 小結(jié)31-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-36
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明36-37
• 附錄37-44
• 綜述 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床研究進(jìn)展44-64
• 綜述參考文獻(xiàn)56-64
• 致謝64-65
• 個人簡歷65

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 杜曉麗;鄭德三;呂紅玲;;絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的影響因素及中醫(yī)證型分布規(guī)律初探[J];世界中醫(yī)藥;2014年06期

2 吳軍;張燕燕;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2007年50期

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本文編號：1033546