本文關(guān)鍵詞：高糖環(huán)境下miR-29c通過Tristetraprolin影響小鼠足細(xì)胞中炎性因子的表達(dá)

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【摘要】：背景糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥,在全球范圍內(nèi)廣泛流行,是終末期腎臟病(end-stage renal disease,ESRD)最常見的病因。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜,目前尚不十分明確。越來越多的證據(jù)表明炎癥激活在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中起促進(jìn)作用。Tristetraprolin(TTP)是一種RNA結(jié)合蛋白,可與多種信使RNA(messager RNA)的3’非編碼區(qū)(3’untranslated region,3’UTR)含有的AU重復(fù)序列(AU-rich element,ARE)結(jié)合,促進(jìn)靶mRNA的降解。已經(jīng)證實(shí),TTP可與多種炎性因子如白介素家族中的IL-6和TNF-α的mRNA結(jié)合并介導(dǎo)其降解,因此TTP又稱為“抗炎蛋白”。在糖尿病腎病患者的血清、尿液中,隨著尿蛋白的增加,TTP的表達(dá)降低,炎性因子IL-6、IL-18的表達(dá)升高,且TTP的表達(dá)變化發(fā)生在炎性因子之前,因此TTP可能參與了糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)。微小RNA(MicroRNAs)是一類從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子RNA,一般由20-22個(gè)核苷酸組成。其與靶mRNA的3’UTR區(qū)的堿基完全或不完全配對(duì)結(jié)合,導(dǎo)致mRNA的降解或抑制蛋白翻譯過程。我們前期基因芯片的結(jié)果顯示,miR-29c在糖尿病腎病患者血漿、尿沉渣、腎組織中均有差異表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道,miR-29c參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展,抑制miR-29c的表達(dá)可以延緩dn的進(jìn)展。但是mir-29c是否參與糖尿病腎病的炎癥反應(yīng),目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。我們應(yīng)用targetscan軟件分析發(fā)現(xiàn)ttp可能是mir-29c的靶基因。由此我們提出假設(shè),在高糖環(huán)境下的小鼠足細(xì)胞中mir-29c通過ttp調(diào)控炎性因子的表達(dá),進(jìn)而參與炎癥反應(yīng)。目的本實(shí)驗(yàn)通過觀察高糖環(huán)境下小鼠足細(xì)胞中mir-29c、ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表達(dá)變化,以及改變mir-29c的表達(dá)后ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表達(dá)變化,探討mir-29c是否參與高糖環(huán)境下的炎癥反應(yīng),并驗(yàn)證這種作用是否通過ttp介導(dǎo),為糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制和診治提供新的理論依據(jù)。方法以條件永生化小鼠足細(xì)胞為研究對(duì)象1.體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞并分為如下三組:正常組(5.6mmol/ld-葡萄糖)、高糖組(25mmol/ld-葡萄糖)、高滲組(5.6mmol/ld-葡萄糖+19.4mmol/ld-甘露醇),分別于不同培養(yǎng)時(shí)間下進(jìn)行檢測(cè)。qrt-pcr檢測(cè)mir-29c,ttp及il-6、tnf-αmrna表達(dá)水平,westernblot檢測(cè)ttp的蛋白表達(dá)水平,elisa檢測(cè)il-6、tnf-α蛋白表達(dá)水平。觀察高糖環(huán)境下小鼠足細(xì)胞中mir-29c、ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表達(dá)變化。2.構(gòu)建野生型和突變型ttp3’utr雙熒光素酶質(zhì)粒,分別與mir-29cmimics共轉(zhuǎn)染小鼠足細(xì)胞,并設(shè)立轉(zhuǎn)染對(duì)照組,轉(zhuǎn)染36h后裂解細(xì)胞,應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性,驗(yàn)證ttp是否是mir-29c的靶基因。3.將mir-29cmimics和inhibitor分別轉(zhuǎn)染入正常糖濃度下培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞,并設(shè)立正常對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組,分別于不同培養(yǎng)時(shí)間下進(jìn)行檢測(cè)。qrt-pcr檢測(cè)mir-29c,ttp及il-6、tnf-αmrna表達(dá)水平,westernblot檢測(cè)ttp的蛋白表達(dá)水平,elisa檢測(cè)il-6、tnf-α蛋白表達(dá)水平。觀察改變mir-29c的表達(dá)后,ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表達(dá)變化。4.體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞并分為如下四組:正常組(5.6mmol/ld-葡萄糖)、高糖組(25mmol/ld-葡萄糖)、高糖轉(zhuǎn)染inhibitor組(25mmol/ld-葡萄糖+mir-29cinhibitor)、高糖轉(zhuǎn)染對(duì)照組(25mmol/ld-葡萄糖+mir-control),分別于不同培養(yǎng)時(shí)間下進(jìn)行檢測(cè)。qrt-pcr檢測(cè)mir-29c,ttp及il-6、tnf-αmrna表達(dá)水平,westernblot檢測(cè)ttp的蛋白表達(dá)水平,elisa檢測(cè)il-6、tnf-α蛋白表達(dá)水平。觀察高糖環(huán)境下,改變mir-29c的表達(dá)后,ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表達(dá)變化。結(jié)果1.高糖環(huán)境下,mir-29c、ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表達(dá)變化與正常對(duì)照組相比,高糖組mir-29c的表達(dá)明顯升高,ttp蛋白及mrna的表達(dá)降低,il-6、tnf-α蛋白及mrna的表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.ttp是mir-29c的靶基因成功構(gòu)建野生型和突變型ttp3’utr-pmirglo質(zhì)粒,分別與mir-29cmimics共轉(zhuǎn)染小鼠足細(xì)胞。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示,與突變型ttp3’utr和mir-29cmimics共轉(zhuǎn)染組相比,野生型ttp3’utr和mir-29cmimics共轉(zhuǎn)染組檢測(cè)到的熒光降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與正常對(duì)照組相比,mir-29cinhibitor轉(zhuǎn)染組ttp蛋白及mrna的表達(dá)升高,mir-29cmimics轉(zhuǎn)染組ttp蛋白及mrna的表達(dá)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.改變mir-29c的表達(dá)后炎性因子il-6、tnf-α的表達(dá)變化與正常對(duì)照組相比,mir-29cinhibitor轉(zhuǎn)染組il-6、tnf-α蛋白及mrna的表達(dá)降低,mir-29cmimics轉(zhuǎn)染組il-6、tnf-α蛋白及mrna的表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4.高糖環(huán)境下,改變mir-29c的表達(dá)后ttp及炎性因子il-6、tnf-α的表達(dá)變化與正常對(duì)照組相比,高糖組ttp蛋白及mrna的表達(dá)降低,il-6、tnf-α蛋白及mrna的表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與高糖組相比,高糖轉(zhuǎn)染mir-29cinhibitor組ttp蛋白及mrna的表達(dá)增加,il-6、tnf-α蛋白及mrna的表達(dá)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論1.高糖影響小鼠足細(xì)胞中miR-29c及炎性因子IL-6、TNF-α的表達(dá)。2.TTP是miR-29c的靶基因。3.高糖環(huán)境下,miR-29c通過TTP調(diào)控小鼠足細(xì)胞中炎性因子的表達(dá),進(jìn)而參與炎癥反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病腎病 小鼠足細(xì)胞 miR-29c TTP 炎性因子 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-14
• 中英文對(duì)照縮略詞14-15
• 前言15-17
• 材料和方法17-41
• 結(jié)果41-51
• 討論51-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 綜述 MIRNAS在糖尿病腎病中的作用59-72
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及在校期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文72-73
• 致謝73

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