本文關(guān)鍵詞：Rspo1通過Wnt信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化

  更多相關(guān)文章： 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 Wnt/β-catenin信號(hào)通路 Rspo1 Wnt3A C2C12細(xì)胞

【摘要】：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為特征的全身性自身免疫病。其病理特點(diǎn)是關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、血管翳形成。研究表明,Wnt信號(hào)通路同類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎引起的骨代謝改變有著密切的聯(lián)系,在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者病情發(fā)展中,Wnt信號(hào)途徑受抑,進(jìn)而抑制了成骨細(xì)胞增殖、分化,促進(jìn)了骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)侵蝕的發(fā)展。近幾年,Rspo1(R-脊椎蛋白1)作為Wnt信號(hào)通路的激活劑被研究甚多,但不清楚它能否通過激活Wnt信號(hào)通路作用于成骨細(xì)胞。目前尚無有效的措施來改善和延緩類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨侵蝕病情的進(jìn)展,明確其骨侵蝕發(fā)生機(jī)制可為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。一、研究目的本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建含有TCF熒光素酶報(bào)告基因的C2C12細(xì)胞,檢測(cè)其在Rspo1、Wnt-3a等刺激下,骨保護(hù)素、堿性磷酸酶及胞內(nèi)β-catenin蛋白含量的變化,以研究Rspo1是否通過Wnt信號(hào)通路來促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,從而為防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨侵蝕增添新理論和新手段。二、研究方法采用DMEM培養(yǎng)基對(duì)C2C12細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。將擴(kuò)增了的C2C12細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),以4×104/ml的濃度加入48孔培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)備用。首先,采用Roche公司x CELLIgence技術(shù)的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)模型分析系統(tǒng),研究RSpo1及Wnt3a對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響。其次,應(yīng)用Lipofectamine 2000將TCF報(bào)告質(zhì)粒及p RL-SV40報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入C2C12細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)。接著,我們通過檢測(cè)骨成熟標(biāo)志物堿性磷酸酶、骨保護(hù)素來驗(yàn)證Rspo1對(duì)C2C12細(xì)胞的作用。處理組細(xì)胞加入50ng/ml的Rspo1刺激因子,空白對(duì)照組為空,采用ELASA檢測(cè)法,收集各組細(xì)胞上清液測(cè)骨保護(hù)素水平,裂解各組細(xì)胞測(cè)胞內(nèi)堿性磷酸酶水平。隨后增加了50ng/ml Wnt3a組和50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a組,同樣采用ELASA檢測(cè)法,收集各組細(xì)胞上清液測(cè)骨保護(hù)素水平,裂解各組細(xì)胞測(cè)胞內(nèi)堿性磷酸酶水平,并采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。β-catenin蛋白是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白,其進(jìn)入核內(nèi)后可與TCF質(zhì)粒相結(jié)合,從而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。通過對(duì)TCF熒光素酶報(bào)告基因和β-catenin蛋白的檢測(cè)可反應(yīng)Wnt信號(hào)通路的激活狀態(tài)。接著,C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)染入TCF報(bào)告質(zhì)粒及p RL-SV40報(bào)告質(zhì)粒6h后,更換含不同濃度的Rspo1、Wnt3a及兩者都有的新鮮完全培養(yǎng)基,24h后應(yīng)用Promega公司的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性。最后,我們對(duì)50ng/ml Rspo1組、50ng/ml Wnt3a組、50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a組以及空白對(duì)照組細(xì)胞的β-catenin蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。三、結(jié)果1.xCELLIgence系統(tǒng)檢測(cè)顯示RSpo1對(duì)C2C12細(xì)胞增殖沒有影響,Wnt3a對(duì)C2C12細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。2.在50ng/ml Rspo1組與空白對(duì)照組兩組之間,使用堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)堿性磷酸酶、Elisa試劑盒檢測(cè)骨保護(hù)素,Rspo1組可上調(diào)堿性磷酸酶活性、促進(jìn)骨保護(hù)素的分泌,進(jìn)行方差分析,兩組之間有顯著性差異,P0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.在50ng/ml Rspo1組、50ng/ml Wnt3a組、50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a組以及空白對(duì)照組四組之間,同樣檢測(cè)堿性磷酸酶、骨保護(hù)素,兩兩之間進(jìn)行分析。50ng/ml Rspo1組與空白對(duì)照組比較,結(jié)果同結(jié)果2一樣;50ng/ml Wnt3a組與空白組比較,兩組之間有顯著性差異,P0.01;50ng/ml Wnt3a組與50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a比較,兩組之間有顯著性差異,P0.01。4.檢測(cè)被濃度遞增的Rspo1、Wnt3a及兩者共刺激處理下細(xì)胞的報(bào)告基因活性,根據(jù)繪制曲線圖,可發(fā)現(xiàn)RSpo1對(duì)TCF報(bào)告質(zhì)粒激活作用不明顯;Wnt3a可激活TCF報(bào)告質(zhì)粒,并且呈劑量依賴性;RSpo1和Wnt3a聯(lián)合則有協(xié)同疊加作用。5.對(duì)50ng/ml Rspo1組、50ng/ml Wnt3a組、50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a組以及空白對(duì)照組四組之間胞內(nèi)的β-catenin進(jìn)行Western Blot檢測(cè),根據(jù)蛋白電泳條帶顏色從深到淺排列順序?yàn)?0ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a組、50ng/ml Wnt3a組、50ng/ml Rspo1組、空白對(duì)照組;50ng/ml Rspo1組與空白對(duì)照組比較,蛋白條帶顏色稍深、柱狀圖稍高,但兩組之間無顯著性差異,P0.05;50ng/ml Wnt3a組與空白對(duì)照組比較,有顯著性差異,P0.05;50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a組與50ng/ml Wnt3a組比較,有顯著性差異,P0.05。四、結(jié)論1.RSpo1并不能促進(jìn)C2C12細(xì)胞的增殖;2.RSpo1可協(xié)同Wnt3A促進(jìn)C2C12細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,表達(dá)堿性磷酸酶、骨保護(hù)素;3.單獨(dú)RSpo1對(duì)Wnt信號(hào)通路激活作用不明顯;4.RSpo1協(xié)同Wnt3A活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路,通過協(xié)同激活該通路參與骨代謝,促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。
【關(guān)鍵詞】：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 Wnt/β-catenin信號(hào)通路 Rspo1 Wnt3A C2C12細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R593.22
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-12
• 前言12-15
• 課題設(shè)計(jì)15-17
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法17-30
• 一、實(shí)驗(yàn)材料17-20
• 二、實(shí)驗(yàn)方法20-30
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-39
• 討論39-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-44
• 綜述 Rspo1通過經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在成骨細(xì)胞分化增殖中調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展44-52
• 綜述參考文獻(xiàn)48-52
• 發(fā)表論文和參加科研工作情況52-53
• 致謝53

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳曉虎;孫瑜隆;騫愛榮;李京寶;商澎;;破骨細(xì)胞的形成和活化研究進(jìn)展[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2014年02期

2 Roel NUSSE;Wnt signaling in disease and in development[J];Cell Research;2005年01期

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本文編號(hào)：1022896