本文關(guān)鍵詞：靶向Ax1抗體的制備與鑒定

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【摘要】：目的:受體酪氨酸激酶作為細(xì)胞跨膜蛋白,在惡性腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、粘附、增殖和遷移等多個(gè)生理過程。因此受體酪氨酸激酶是癌癥治療和藥物研發(fā)的熱門分子靶點(diǎn)。Axl是受體酪氨酸激酶TAM家族成員之一,Axl及其配體Gas6在許多惡性腫瘤中都有高表達(dá)。近年來,Axl/Gas6作為癌癥治療的新靶點(diǎn)引起了廣泛關(guān)注。單克隆抗體藥物以其特異性強(qiáng)、安全性高、毒性低、臨床療效好等優(yōu)點(diǎn),在腫瘤靶向治療中發(fā)揮重要作用。針對(duì)Axl靶點(diǎn)開發(fā)特異性候選抗體藥物,將為腫瘤臨床治療提供更多選擇。方法:本研究通過雜交瘤技術(shù)制備靶向Axl功能性單克隆抗體。借助生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)對(duì)Axl胞外段進(jìn)行序列、結(jié)構(gòu)分析,將Axl參與與Gas6相互作用的功能域基因克隆到pGEX-4T-1表達(dá)載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中,以IPTG誘導(dǎo)、表達(dá)并純化獲得目標(biāo)蛋白。利用目標(biāo)蛋白免疫BALB/c小鼠,經(jīng)過細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng),利用ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、Western印跡等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗體篩選;釣取目標(biāo)抗體基因,進(jìn)行基因序列比對(duì)分析;進(jìn)一步通過競(jìng)爭ELISA、抑制增殖、劃痕實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)抗體體外生物學(xué)活性。結(jié)果:1、抗原的制備對(duì)人Axl胞外段進(jìn)行序列、結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果提示Axl胞外區(qū)的Ig-like-C2-type-1(27-128aa)為Gas6識(shí)別的功能域。將包含Axl全長中第27-128aa(F1)的基因克隆到表達(dá)載體pGEX-4T-1中,構(gòu)建pGEX-4T-1-F1表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,優(yōu)化后獲得GST-F1可溶性表達(dá)并親和純化;經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western印跡等實(shí)驗(yàn)方法鑒定,表達(dá)純化獲得的蛋白為預(yù)期的GST-F1融合蛋白,為免疫動(dòng)物制備單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。2、抗Axl mAb的制備、篩選和鑒定GST-F1融合蛋白免疫BALB/c小鼠后進(jìn)行雜交瘤融合,以GST-F1融合蛋白進(jìn)行elisa篩選,同時(shí)以gst蛋白進(jìn)行負(fù)性篩選,挑取特異性識(shí)別gst-f1而不與gst蛋白結(jié)合的抗體克隆。進(jìn)一步結(jié)合流式細(xì)胞篩選,最終獲得2株穩(wěn)定分泌抗axlmab的雜交瘤細(xì)胞株(8-11,16-7)。擴(kuò)大培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞8-11、16-7,制備小鼠腹水,經(jīng)純化獲得抗體。利用小鼠單克隆抗體亞型檢測(cè)試劑盒分析,顯示2株抗體株抗體的重鏈亞類為igg3,輕鏈為κ型。elisa結(jié)果顯示,篩選得到的2株抗axlmabs不僅可以特異性識(shí)別gst-f1抗原,同時(shí)可以特異性識(shí)別真核表達(dá)的axl胞外段與人igg-fc融合蛋白(fc-axl-ecd);利用axl高表達(dá)的細(xì)胞株進(jìn)行westernblot以及流式細(xì)胞分析,結(jié)果顯示篩選得到的2株抗axlmabs可以特異性識(shí)別天然表達(dá)的axl蛋白。釣取了2株抗體的基因并測(cè)得基因序列,所得序列在genbank中與抗體核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果顯示2株抗體的輕鏈和重鏈的可變區(qū)序列與提交的小鼠igg可變區(qū)序列的同源性均超過96%,確定基因序列為抗體序列;分析抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因,確定抗體的fr區(qū)和cdr區(qū)。3、抗axl單克隆抗體體外生物學(xué)活性競(jìng)爭elisa、抑制增殖、劃痕實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,獲得的兩株抗axl單克隆抗體具有良好的體外生物學(xué)活性。競(jìng)爭elisa的結(jié)果顯示,抗axlmab能特異性競(jìng)爭gas6結(jié)合axl蛋白。借助axl高表達(dá)的mda-mb-231細(xì)胞進(jìn)行抗體生物學(xué)活性評(píng)價(jià),結(jié)果顯示抗axlmab使內(nèi)源性的axl含量減少,并同時(shí)抑制其磷酸化,抑制增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,篩選獲得的抗axlmab對(duì)mda-mb-231細(xì)胞的增殖無明顯影響;transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抗axlmab抗體能顯著抑制mda-mb-231細(xì)胞遷移能力。結(jié)論:1、通過計(jì)算機(jī)模擬分析,確定人axl與gas6相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,并經(jīng)原核表達(dá)、純化,獲得了純度較高的gst-f1的融合蛋白片段。2、通過雜交瘤技術(shù)獲得了2株特異性識(shí)別人axl的單克隆抗體8-11,16-7。3、抗axlmab在一定程度上可以特異性阻斷gas6與axl結(jié)合,下調(diào)axl表達(dá),抑制axl磷酸化;抗axlmab抗體對(duì)mda-mb-231細(xì)胞遷移能力有抑制作用,但是對(duì)其抑制增殖無明顯影響。
【關(guān)鍵詞】：Axl anti-Axl抗體 腫瘤遷移
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-12
• 前言12-16
• 材料與方法16-25
• 結(jié)果25-30
• 附圖30-44
• 討論44-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 綜述 靶向Axl藥物在癌癥治療中的研究進(jìn)展52-62
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 致謝62-63
• 個(gè)人簡歷63

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本文編號(hào)：997709