本文關(guān)鍵詞：人尿源干細(xì)胞來源的外泌體對1型糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 人尿源干細(xì)胞 外泌體 糖尿病腎病 足細(xì)胞 凋亡

【摘要】：目的：糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥,也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。DN病理早期表現(xiàn)為足細(xì)胞凋亡、數(shù)量減少,引發(fā)濾過膜功能障礙,最終造成大量蛋白尿和腎功能衰竭。因此,抑制足細(xì)胞凋亡,減少蛋白尿是DN預(yù)防和治療中的關(guān)鍵問題。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞對DN有良好的治療作用,這種作用可能與干細(xì)胞的旁分泌機(jī)制有關(guān)。其中,外泌體(Exosomes)是干細(xì)胞旁分泌機(jī)制中發(fā)揮作用的有效成分。但是用干細(xì)胞來源的Exosomes治療DN的研究罕有報道。本課題通過建立1型DN大鼠模型,研究USCs來源的Exosomes (USCs-Exo)對DN腎臟損傷的保護(hù)作用,探討其可能的機(jī)制。方法：①USCs及其分泌USCs-Exo的分離、培養(yǎng)、鑒定：采用特定培養(yǎng)基從人的尿液中分離USCs,通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面標(biāo)記分子,并對其多向分化潛能進(jìn)行鑒定。采用超高速離心法從USCs培養(yǎng)上清中提取USCs-Exo,透射電鏡分析其形態(tài)、大小,蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)法檢測特異性蛋白CD9、CD63和CD81的表達(dá)。②1型糖尿病大鼠模型的建立、分組：采用鏈脲佐菌素腹腔注射構(gòu)建1型糖尿病大鼠模型,實驗分為：正常對照組(Normal),糖尿病組(Diabetes)和糖尿病USCs-Exo治療組(Diabetes+USCs-Exo).③USCs-Exo對1型糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用：每周檢測各組大鼠的隨機(jī)血糖,每4周檢測血清肌酐、尿素氮,收集24小時尿液檢測尿肌酐、尿白蛋白水平,計算尿微量白蛋白/肌酐(urinary microalbumin-to-creatinine ratio, UACR)。12周后處死大鼠,PAS染色進(jìn)行腎組織病理學(xué)檢查,普通光學(xué)顯微鏡觀察腎小球系膜基質(zhì)增生變化,并計算腎小球系膜面積(Mesangial area) TUNEI去染色觀察腎小球細(xì)胞凋亡情況Real time PCR去和Westernblotting法檢測)腎臟組織的凋亡相關(guān)Bcl-2、Bax和Caspase-3基因和蛋白的表達(dá)水平。④USCs-Exo對體外高糖刺激的人足細(xì)胞(Human Podocyte, HPDC)的保護(hù)作用：USCs-Exo干預(yù)高糖培養(yǎng)HPDC分為——正常葡萄糖對照組(NG組)、甘露醇高滲對照組(MA組)、高糖組(HG組)、HG+ USCs-Exo (5ug/ml, 10ug/ml和50ug/m1)干預(yù)組；72小時后,采用Annexin V-FITC/PI雙染后流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率,Western blotting法檢測HPDC凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá),Real time PCR檢測足細(xì)胞特異性分子Synaptopodin的基因相對表達(dá)量。結(jié)果：①從新鮮尿液中成功分離出USCs和USCs-Exo,為進(jìn)一步的實驗設(shè)計提供了充足可靠的原料：USCs培養(yǎng)5-7天后開始貼壁生長,12-16天類似成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞呈集落生長,傳代23次后細(xì)胞逐漸被拉長,保持均一的成纖維細(xì)胞樣生長。USCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相似的表面分子CD29、CD90、CD73、CD44,不表達(dá)CD34和HLA-DR,表明USCs符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征,同時USCs在體外經(jīng)成骨、成脂培養(yǎng)基的誘導(dǎo)培養(yǎng)后,USCs成功分化為成骨、成脂細(xì)胞。從P3代USCs的條件培養(yǎng)基中提取出USCs-Exo,經(jīng)透射電鏡檢查USCs-Exo大小在30-120nm,囊泡樣,表達(dá)進(jìn)化上相對保守的蛋白CD9、CD63和CD81。②USCs-Exo能改善糖尿病大鼠UACR,減少腎小球系膜增生,減少組織細(xì)胞的凋亡,改善腎臟功能,延緩DN的發(fā)生、發(fā)展：同Normal組相比,Diabetes組的大鼠尿量和UACR顯著性升高(P0.05),4周即達(dá)到DN標(biāo)準(zhǔn)；Diabetes+USCs-Exo組4周、8周、12周UACR (19.2±2.3mg/g,26.4±2.9mg/g, 23.4±3.2mg/g)較同時間點Diabetes組UACR (43±4.5mg/g,55±6.0 mg/g,74.7±5.8mg/g)明顯減少,并且沒有達(dá)到DN的微量白蛋白尿標(biāo)準(zhǔn)；同Normal組相比,Diabetes組腎臟病理檢查示腎小球體積增大、系膜區(qū)增寬、系膜基質(zhì)明顯增多；腎小球內(nèi)存在明顯的細(xì)胞凋亡,Bcl-2的基因和蛋白表達(dá)顯著降低,Bax和Caspase-3顯著升高。而Diabetes+USCs-Exo治療組的腎臟病理和凋亡相關(guān)Bcl-2、Bax、Caspase-3的改變均得到顯著性改善(P0.05)③USCs-Exo能減少體外高糖導(dǎo)致的HPDC凋亡和損傷：同NG組相比,HG組在培養(yǎng)72小時后,HPDC synaptopodin表達(dá)下降,在72h的凋亡率明顯升高(P0.05), Caspase-3表達(dá)增多(P0.05)。與HG組相比,USCs-Exo治療組抑制synaptopodin的表達(dá)下調(diào),以USCs-Exo濃度依賴性的減少HPDC凋亡率(P0.05),并下調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)(P0.05)。結(jié)論：①USCs及USCs-Exo對1型糖尿病大鼠的腎臟和體外高糖損傷的HPDC具有保護(hù)作用。②USCs-Exo可能是通過抑制體內(nèi)外高糖引發(fā)的足細(xì)胞凋亡和損傷起到保護(hù)腎臟的作用
【關(guān)鍵詞】：人尿源干細(xì)胞 外泌體 糖尿病腎病 足細(xì)胞 凋亡
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 前言11-13
• 材料和方法13-30
• 實驗結(jié)果30-38
• 討論38-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 綜述49-58
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 中英文對照縮略詞表58-59
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文59-60
• 致謝60-61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉伯軒;劉師偉;王建華;樊彩蘭;李晶;李華青;岳曉華;張悅紅;劉卓拉;牛勃;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后2型糖尿病鼠血糖及腎臟病變的改善[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年10期

2 楊曉燕;潘興華;阮光萍;龐榮清;蔡學(xué)敏;;干細(xì)胞移植治療糖尿病腎病[J];中國組織工程研究;2013年01期

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本文編號：967679