本文關(guān)鍵詞：HELQ對(duì)生殖細(xì)胞分化影響的研究

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【摘要】：依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)評(píng)估,全球不孕不育的比例已經(jīng)占到育齡夫婦的15%。而其中男性不育患者已經(jīng)占據(jù)人類不孕不育患者總量的一半左右。利用干細(xì)胞結(jié)合基因編輯技術(shù),建立體外生殖分化疾病模型來研究男性不育疾病的機(jī)制,將會(huì)有非常好的應(yīng)用前景。HELQ,名為類似于POLQ的解旋酶(Helicase,POLQ-like),是一種DNA依賴性的ATP酶及DNA解旋酶,它在DSB(DNA Double-Strand Breaks)以及DNA鏈間交聯(lián)(Inter-strand Cross Link,ICL)的修復(fù)過程中都發(fā)揮著重要作用。HELQ可以直接與RAD51的旁系同源復(fù)合物RAD51B/C/D,XRCC2以及DNA損傷相應(yīng)激酶ATR作用。有研究表明,HELQ功能缺陷的小鼠出現(xiàn)類似唯支持細(xì)胞綜合征(Sertoli Cell Only Syndronie,SCOS)表型,提示HELQ可能在性原細(xì)胞階段或者原始生殖細(xì)胞階段發(fā)揮作用。在本實(shí)驗(yàn)中,通過利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)獲得能穩(wěn)定傳代的HELQ敲除的小鼠雄性胚胎干細(xì)胞系(Embryonic stem cell,ES)。免疫熒光染色結(jié)果顯示敲除HELQ后,Oct3/4及Nanog的表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異,利用四倍體補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)證明胚胎干細(xì)胞的多能性不受影響,能夠獲得健康的四倍體小鼠子代。同時(shí)我們利用HELQ敲除的胚胎干細(xì)胞在特定的培養(yǎng)條件下繼續(xù)進(jìn)行體外分化,最終可以得到第二天(Day2)的上胚層類似細(xì)胞(Epiblast Like cells,Epi LCs)。通過免疫熒光染色及Real-time PCR分析,結(jié)果表明HELQ敲除的胚胎干細(xì)胞分化為上胚層細(xì)胞無明顯異常。說明敲除該基因后不會(huì)影響胚胎干細(xì)胞的多能性及定向分化。因此,我們按照體外生殖細(xì)胞分化體系繼續(xù)將上胚層類似細(xì)胞按照生殖細(xì)胞方向分化,通過流式分析可知敲除HELQ后,形成較低比例的Blimp1和Stella陽性細(xì)胞,其比例與對(duì)照組相比相差2-3倍,說明HELQ對(duì)生殖細(xì)胞的分化具有一定的影響作用。雖然并未對(duì)其影響原因做進(jìn)一步的研究,但是這將對(duì)男性不育治療提供更多的理論和技術(shù)支持,為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供新的研究思路和重要依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：HELQ 生殖細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞 上胚層類似細(xì)胞 CRISPR-Cas9
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R698.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 前言10-21
• 1.1 HELQ的作用及研究進(jìn)展10-11
• 1.2 生殖細(xì)胞的研究進(jìn)程11-16
• 1.2.1 PGCs體內(nèi)的發(fā)育歷程11-12
• 1.2.2 PGCs形成的重要事件12-15
• 1.2.3 PGCs形成過程中表觀遺傳的重編程15-16
• 1.2.4 PGCs特化的信號(hào)通路16
• 1.3 生殖細(xì)胞體外分化的研究進(jìn)展16-17
• 1.4 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的介紹及應(yīng)用17-19
• 1.5 研究目的及意義19-21
• 第二章 材料與方法21-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21
• 2.1.1 動(dòng)物21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑的配制21-22
• 2.3 方法步驟22-32
• 2.3.1 HELQ敲除ES細(xì)胞系的建立及鑒定22-25
• 2.3.2 CF1小鼠胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及制作飼養(yǎng)層細(xì)胞25-26
• 2.3.3 小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)及上胚層樣細(xì)胞的分化26
• 2.3.4 小鼠HELQ~(-/-)四倍體的獲得26-28
• 2.3.5 HELQ~(-/-) ES及EpiLCs多能性的檢測28-30
• 2.3.6 PGCLCs 細(xì)胞的獲得及流式分析30-32
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-39
• 3.1 建立HELQ敲除（HELQ~(-/-)）小鼠胚胎干細(xì)胞系32-33
• 3.2 小鼠HELQ~(-/-) ES細(xì)胞多能性的鑒定33-34
• 3.3 HELQ~(-/-) ES細(xì)胞向EpiLCs的定向分化及鑒定34-36
• 3.4 HELQ敲除后對(duì)PGCLCs的分化的影響及分析36-39
• 第四章 總結(jié)與討論39-42
• 4.1 主要結(jié)論39
• 4.2 討論39-42
• 參考文獻(xiàn)42-51
• 研究生期間論文發(fā)表情況51-52
• 縮寫表（中英文對(duì)照）52-53
• 致謝53

【相似文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王文婷;C10ORF2,HELQ和PRIM1基因在原發(fā)性卵巢功能不全中的作用和相關(guān)機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2016年

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1 萬聰;HELQ對(duì)生殖細(xì)胞分化影響的研究[D];湖南師范大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：959767