本文關鍵詞：晚期氧化蛋白產(chǎn)物通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導腎小管上皮細胞肥大及轉(zhuǎn)分化

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【摘要】：慢性腎臟病(chronic kidney diseases, CKD)可導致終末期腎病(end-stage of renal disease, ESRD),是一個非常嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題。現(xiàn)已知腎臟纖維化主要由腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化構(gòu)成,而腎間質(zhì)纖維化是各種CKD發(fā)展至終末期腎衰竭的主要病理基礎和共同最后途徑。近年來大量研究表明,腎功能的損害程度與腎小管間質(zhì)病變的嚴重程度直接相關。由于腎小管間質(zhì)體積大約占腎臟總體積的90%,故腎小管上皮細胞肥大為腎臟肥大的主要原因之一。已知健存腎單位代償性肥大是慢性腎功能衰竭進行性發(fā)展機制的重要機制之一,代償性肥大的腎小管上皮細胞出現(xiàn)高代謝,氧耗增加、氧自由基生成增多,進一步加重腎小管間質(zhì)損傷；同時,肥大的腎小管上皮細胞通過分泌細胞因子、化學趨化因子、血管活性物質(zhì),表達粘附分子對腎細胞及單核／巨噬細胞的增生、分化、趨化起調(diào)節(jié)作用,并可轉(zhuǎn)分化為成纖維細胞,直接促進腎臟纖維化的發(fā)生和慢性腎衰竭的進行性惡化。而且既往研究顯示初期腎小管的適應性肥大將逐漸發(fā)展至適應不良,并導致腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化。綜上可知,腎小管上皮細胞肥大與CKD發(fā)病機制密切相關。越來越多的研究表明,腎臟固有細胞如系膜細胞、腎小管上皮細胞等在炎癥、損傷、缺氧等條件下可發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,即失去其本身固有的細胞表型,轉(zhuǎn)化成為肌成纖維細胞,進而導致腎間質(zhì)的纖維化。盡管目前對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化如何影響腎間質(zhì)纖維化和促腎小管間質(zhì)纖維化的細胞機制均存在爭議,但許多研究表明腎小管上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-to-mesenchymal trasition, EMT)可導致腎間質(zhì)纖維化,且EMT在CKD發(fā)病機理中始終起著重要的作用。因此,研究腎小管上皮細胞發(fā)生EMT的機制,阻斷EMT的發(fā)生,對于干預CKD的進展具有十分重要的意義。晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products, AOPPs)是由血清蛋白與含氯氧化物在氧化應激過程中生成的一類含雙酪氨酸的蛋白交聯(lián)物,由Witko-Sarsat等于1996年首次報導。CKD患者體內(nèi)早期即可檢測到AOPPs明顯增高,并且AOPPs的升高水平與腎功能損傷程度成正相關。此外,越來越多的證據(jù)也表明AOPPs可促進CKD的進展。已有研究報道AOPPs可誘導腎臟足細胞凋亡,腎小管上皮損傷,腎臟系膜細胞增生及分化。然而,盡管研究表明眾多因素可誘導腎小管上皮細胞肥大及轉(zhuǎn)分化,但AOPPs是否可引起腎小管上皮細胞肥大及轉(zhuǎn)分化目前尚不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum, ER)負責新生蛋白、分泌蛋白、膜相關蛋白的正確折疊和組裝,是人體細胞主要的加工廠。各種因素(比如低氧環(huán)境)可引起ER功能紊亂,導致未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔內(nèi)蓄積和Ca2+平衡紊亂,此類狀態(tài)稱之為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER stress, ERS)。ERS是細胞的一種自我保護機制,ERS發(fā)生未折疊蛋白反應時不僅能激活適應性通路又能激發(fā)凋亡通路。初期適度的ERS有助于增強細胞耐受應激刺激的能力,持續(xù)而嚴重的ERS則可能造成細胞的肥大、增生、分化甚至凋亡。如今ERS越來越受到廣泛關注,ERS與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關,比如糖尿病腎病、毒物或藥物引起的腎小管上皮細胞損傷、腎臟缺血再灌注損傷以及CKD等�，F(xiàn)已有體外實驗證明,AOPP可通過ERS誘導脂肪細胞炎癥反應。但AOPPs是否可引起ERS及其如何通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激影響腎小管上皮細胞肥大和發(fā)生EMT仍需進一步研究。目前已有文獻表明在CKD的發(fā)生發(fā)展過程中活性氧起著非常重要的作用,在CKD病人中,氧化應激狀態(tài)的增高被認為是主要的致病因素之一�；钚匝醮�(Reactive oxygen species, ROS)能夠誘導細胞出現(xiàn)增殖、肥大與凋亡等病理性改變。在正常生理環(huán)境下,腎臟自身會生成一些活性氧,包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等。正常情況下,體內(nèi)的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶以及維生素E等可以有效的清除這些活性氧。然而當體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生超過抗氧化系統(tǒng)負荷時,氧化應激就會造成組織的損害,所以活性氧的平衡對于腎臟組織的結(jié)構(gòu)及其功能有著重要作用。已知氧化應激可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,但其是否參與AOPPs誘導的腎小管上皮細胞肥大及轉(zhuǎn)分化尚需進一步研究�；谏鲜鲅芯勘尘�,本研究擬通過在體外條件下以AOPP培養(yǎng)人近端腎小管上皮細胞,檢測細胞周期分布的相關變化,CHOP、GRP78、α-SMA、E-cadherin、p27的蛋白表達及mRNA的表達水平變化。經(jīng)NADPH氧化酶抑制劑、活性氧抑制劑(SOD)、ERS抑制劑干預細胞后檢測上述各項指標的變化。從而進一步探討AOPP是否可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導腎小管上皮細胞肥大和轉(zhuǎn)分化,以及氧化應激是否參與了該過程及與ERS的關系。本實驗結(jié)果將為CKD的早期防治提供新的實驗依據(jù)。一.研究目的本研究的主要目的是探討AOPPs是否可導致腎小管上皮細胞肥大和發(fā)生EMT,并研究ERS是否是AOPPs誘導腎小管上皮細胞肥大和發(fā)生EMT的主要細胞內(nèi)機制之一。此外,本研究還探討了氧化應激是否參與了此過程及與ERS的關系。本研究的結(jié)果將為早期干預治療CKD提供新的治療靶點。二.研究方法1. AOPP的制備AOPPs牛血清白蛋白按文獻報導配制。次氯酸溶液與血清白蛋白(BSA)以140/1的摩爾比例混合,于室溫下(25～30℃)反應30分鐘,以PBS透析24小時去除殘留次氯酸。對照組未經(jīng)修飾的牛血清蛋白直接融入PBS即可。所得樣品用Detoxi-Gel凝膠柱去除內(nèi)毒素。所有制備的AOPP經(jīng)鱟試驗法檢測內(nèi)毒素含量均低于0.25 EU/ml。AOPP含量的測定方法：在酸性條件下340nm處測定溶液的吸光度值,以氯胺T為標準取得。2.實驗細胞：人近端腎小管上皮細胞株HK-2的培養(yǎng)HK-2細胞于美國ATCC庫購買,在37℃、5%CO2條件下的含10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中孵育。觀察細胞長至80%以上融合時,以0.25%胰酶消化后接種至6孔培養(yǎng)板繼續(xù)傳代培養(yǎng),待細胞長至70%-80%左右時用于后續(xù)實驗。3. AOPP以濃度依賴的方式誘導腎小管上皮細胞肥大和發(fā)生EMT腎小管上皮細胞分別與50 μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml AOPPs共同孵育24小時,50μg/ml BSA作為陰性對照組,另設一組HK-2細胞作為空白對照。收集細胞樣本,分別采用Western blot檢測CHOP、GRP78、p27、α-SMA、 E-cadherin蛋白表達量及總蛋白含量,Real Time Quantitative PCR(RT-PCR)檢測CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin的mRNA表達水平。使用流式細胞儀來分析細胞周期分布情況。4. AOPP以時間依賴的方式誘導腎小管上皮細胞肥大和發(fā)生EMT腎小管上皮細胞分別與200μg/ml AOPP、50μg/ml BSA孵育不同時間(30min、1h、3h、6h、12h、24h),收集細胞樣本,采用Western blot檢測CHOP、 GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin蛋白表達量及總蛋白含量,以RT-PCR檢測CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin 的 mRNA表達水平。使用流式細胞儀來分析細胞周期分布情況。5.ERS在AOPP誘導的腎小管上皮細胞肥大和轉(zhuǎn)分化中的作用分別以200μg/ml AOPPs、50μg/ml BSA、50μmol/L salubrinal (ERS抑制劑)、0.25μmol/L thapsigargin(ERS誘導劑)預處理腎小管上皮細胞1h后再加入200μg/ml AOPP刺激細胞,共同孵育24小時。收集各組細胞樣本,采用Western blot和RT-PCR檢測CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin蛋白及mRNA表達量,以流式細胞儀檢測細胞周期。6.氧化應激在AOPP誘導的腎小管上皮細胞肥大和轉(zhuǎn)分化中的作用分別以200μg/ml AOPPs、50lg/ml BSA、10μmol/L DPI (NADHP氧化酶抑制劑)或200U/ml SOD(氧自由基清除劑)預處理腎小管上皮細胞1h后再加入200μg/ml AOPP刺激細胞,共同孵育24小時。收集各組細胞樣本,采用Westernblot和RT-PCR檢測CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin蛋白及mRNA表達量,以流式細胞儀檢測細胞周期。三.研究結(jié)果1. AOPP以劑量時間依賴方式誘導腎小管上皮細胞肥大本實驗通過測定HK-2細胞內(nèi)總蛋白含量研究AOPPs是否會引起腎小管上皮細胞肥大。實驗結(jié)果表明AOPP刺激使HK-2細胞內(nèi)總蛋白含量顯著增加(Fig.1)。此外,本實驗還檢測了p27的蛋白及mRNA表達情況以及細胞周期分布情況。AOPPs刺激以劑量時間依賴性誘導p27蛋白(Fig.2, A B)及其基因(Fig.2,C＆D)過表達,同時使得G1期細胞(Fig.2 EF)百分比增加。盡管AOPP刺激組細胞培養(yǎng)24h后,細胞內(nèi)p27蛋白表達量、總蛋白含量、G1期細胞數(shù)量均未達到最高值,但其表達水平均顯著高于對照組(p0.05)。并且上述改變在對照組和未經(jīng)修飾的BSA組均未觀察到。這些實驗結(jié)果表明：p27蛋白過表達、總蛋白蓄積、G1期細胞百分比增加均與血清蛋白的晚期氧化有關。簡言之,本實驗通過觀察AOPPs引起p27過表達及G1期細胞百分比增加,說明AOPPs可誘導腎小管上皮細胞肥大。2. AOPP以劑量時間依賴方式誘導腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化本實驗通過檢測E-cadherin和α -SMA蛋白及mRNA的表達來觀察AOPPs是否可引起腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化。E-cadherin蛋白和mRNA的表達隨著AOPP刺激濃度的增高和時間的延長而下調(diào),a-SMA蛋白和mRNA的表達則隨著AOPP刺激濃度的增高和時間的延長而上調(diào)(Fig.3)。AOPP刺激誘導α-SMA的mRNA表達水平在12h時上升達最高峰,24h時下降,但其表達水平始終顯著高于對照組(P0.05)。對照組和未經(jīng)修飾的血清蛋白(BSA)組,E-cadherin和α-SMA蛋白表達水平無明顯改變,這說明E-cadherin蛋白丟失和α-SMA蛋白過表達均與血清蛋白的晚期氧化相關。綜上可知,AOPPs可引起腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化。3. AOPP誘導腎小管上皮細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應本實驗通過RT-PCR法和western-blot法檢測GRP78和CHOP蛋白及mRNA表達水平,研究AOPPs刺激是否可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生。與對照組和未修飾BSA組相比,AOPPs刺激組GRP78和CHOP蛋白及其mRNA表達水平均顯著增高(Fig.4)。盡管AOPP刺激組GRP78和CHOP蛋白及mRNA表達水平未在24h達最大值,但其表達水平始終明顯高于對照組。以上數(shù)據(jù)說明AOPPs可誘導腎小管上皮細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。4. AOPP通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導腎小管上皮細胞肥大及轉(zhuǎn)分化為了研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在AOPP誘導的腎小管上皮細胞肥大及發(fā)生轉(zhuǎn)分化中的作用,本實驗在各組HK-2細胞內(nèi)加入試劑如下：第一組為空白對照組,第二組為白蛋白對照組,第三組為200 μg/mLAOPPs刺激組,第四組為AOPPs+salubrinal(可激活eIF2 a,減輕細胞ERS)組,第五組為thapsigargin(細胞ERS誘導劑)組,經(jīng)RT-PCR法和Western Blot法檢測各組CHOP、GRP78、 p27、E-cadherin和α-SMA蛋白及mRNA表達情況。AOPP在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平誘導CHOP, GRP78, p27和α-SMA蛋白過表達,抑制E-cadherin蛋白表達,上述現(xiàn)象經(jīng)ERS抑制劑處理后可部分逆轉(zhuǎn),而ERS誘導劑則可直接誘導細胞上述現(xiàn)象的發(fā)生(Fig.5)。此外,ERS抑制劑可部分抑制AOPP誘導的腎小管上皮細胞G1期細胞百分比和總蛋白含量的增加,而ERS誘導劑則引起腎小管上皮細胞G1期細胞百分比和總蛋白含量的增加(Fig.6)。所以,本實驗結(jié)果提示AOPP通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導腎小管上皮細胞肥大及轉(zhuǎn)分化。5.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與氧化應激相關為研究腎小管上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過程中氧化應激的作用,本實驗在各組HK-2細胞內(nèi)加入試劑如下：第一組為空白對照組,第二組為白蛋白對照組,第三組為200 μg/mLAOPPs刺激組,第四組為AOPPs+DPI (NADPH氧化酶抑制劑)組,第五組為AOPPs+SOD(總的活性氧抑制劑)組,經(jīng)RT-PCR法和Western Blot法檢測各組CHOP、GRP78、p27、E-cadherin和α-SMA蛋白及mRNA表達情況。實驗結(jié)果提示AOPP可下調(diào)E-cadher in的表達,NADPH氧化酶抑制劑和ROS抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)AOPP引起的HK-2細胞總蛋白含量和G1期細胞百分比的增加(Fig.6),同時也可抑制AOPP誘導的a-SMA.CHOP和GRP78的過表達(Fig.5)。綜上所述,本實驗結(jié)果提示氧化應激在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的上游或下游通路中起作用,并參與了AOPP誘導的腎小管上皮細胞肥大及轉(zhuǎn)分化過程。四.研究結(jié)論本實驗研究結(jié)果證實晚期氧化蛋白產(chǎn)物可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導腎小管上皮細胞肥大及轉(zhuǎn)分化。此外,本實驗結(jié)果提示了氧化應激反應也參與了AOPP誘導腎小管上皮細胞肥大和發(fā)生EMT的過程,且與ERS有關。本實驗結(jié)果將為早期干預CKD的進展提供新的治療靶點。
【關鍵詞】：晚期氧化蛋白產(chǎn)物 腎小管上皮細胞 肥大 轉(zhuǎn)分化 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R692
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-25
• 材料與方法25-51
• 實驗結(jié)果51-72
• 討論72-75
• 全文結(jié)論75-76
• 參考文獻76-82
• 英文縮略詞表82-84
• 攻讀學位期間成果84-85
• 致謝85-86

【共引文獻】

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本文編號：956624