本文關(guān)鍵詞：CTP-NPRL2融合蛋白對腎癌原代細(xì)胞遷移侵襲能力的抑制及機(jī)制研究

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【摘要】：目的將原核表達(dá)的氮酶調(diào)節(jié)因子2(nitrogen permease regulator 2-like,NPRL2)融合蛋白通過胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)轉(zhuǎn)入腎癌原代細(xì)胞內(nèi),觀察其對腎癌原代細(xì)胞遷移侵襲的影響,并分析與腎癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的關(guān)系。方法膠原酶消化法培養(yǎng)腎癌原代細(xì)胞;構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET15b-CTP-NPRL2和pET15b-NPRL2,表達(dá)融合蛋白CTP-NPRL2和NPRL2,并通過Western blot鑒定目的蛋白的表達(dá)。將培養(yǎng)成功的原代細(xì)胞分為BLANK組、NPRL2組和CTP-NPRL2組。免疫熒光檢測目的蛋白的細(xì)胞定位;Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測導(dǎo)入NPRL2蛋白后,對腎癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響;Real-time PCR檢測Raptor、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纖粘蛋白(Fibronectin)m RNA表達(dá)水平;Western blot檢測Raptor、E-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白表達(dá)水平。結(jié)果成功培養(yǎng)出腎癌原代細(xì)胞并通過鑒定;測序結(jié)果及Western blot檢測結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功并表達(dá)出目的蛋白;免疫熒光檢測結(jié)果顯示CTP-NPRL2融合蛋白可以穿過胞膜并定位于胞漿;遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示CTP-NPRL2組腎癌細(xì)胞遷移侵襲能力明顯下降(P0.05);Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示CTP-NPRL2組Raptor、Vimentin與Fibronectin的m RNA、蛋白表達(dá)水平與NPRL2組和BLANK組相比明顯降低(P0.05),而E-cadherin的mRNA、蛋白表達(dá)水平與NPRL2組與BLANK組相比明顯升高(P0.05)。結(jié)論 NPRL2可能通過與Raptor相互作用影響mTORC1的活性,進(jìn)而調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin、Fibronectin的表達(dá)量,影響腎癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科;
【關(guān)鍵詞】： NPRL mTORC 遷移 侵襲 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
【基金】：[基金項(xiàng)目]重慶市科學(xué)技術(shù)委員會應(yīng)用開發(fā)(CSTC2013yykfA 110004)~~
【分類號】：R737.11
【正文快照】： 院泌尿外科)confirmed the successful culture of primary RCC cells derived from patient specimens.After plasmidconstruction and transfection,the expression of fusion proteins CTP-NPRL2 and NPRL2 were detected byWestern blotting.Green fluorescence was only ，

本文編號：891656