本文關(guān)鍵詞：C3aR慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及在腎小管上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

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【摘要】：目的前期研究發(fā)現(xiàn)C3aR在糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),但其在糖尿病腎病中的病理意義未知,且有關(guān)腎組織C3aR的確切生理和病理意義亦仍不清楚。文中通過構(gòu)建C3aR慢病毒表達(dá)載體和過表達(dá)C3aR的腎小管上皮細(xì)胞株,為探討C3aR在腎組織小管上皮細(xì)胞中的確切生理和病理意義提供細(xì)胞模型。方法根據(jù)人C3aR mRNA序列合成人C3aR基因,將其克隆到慢病毒表達(dá)載體p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位點(diǎn),構(gòu)建成C3aR慢病毒表達(dá)載體p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP;經(jīng)測序驗(yàn)證正確后,用構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝成C3aR表達(dá)重組慢病毒;以C3aR表達(dá)重組慢病毒感染人腎小管上皮細(xì)胞系HK2,經(jīng)藥物篩選得到殺稻瘟菌素抗性細(xì)胞克隆;經(jīng)熒光定量PCR分析和細(xì)胞免疫化學(xué)分析,鑒定出穩(wěn)定過表達(dá)C3aR的人腎小管上皮細(xì)胞株。結(jié)果 1對構(gòu)建成的C3aR慢病毒表達(dá)載體p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP進(jìn)行全序列測序驗(yàn)證顯示序列完全正確。2以構(gòu)建的C3aR慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒(p LP1、p LP2和p LP/VSVG)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,得到了滴度約為5×108個(gè)/m L的慢病毒液。3成功進(jìn)行了C3aR重組慢病毒對HK2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了C3aR重組慢病毒的HK2細(xì)胞株HK2-C3aR;基于熒光定量PCR和細(xì)胞免疫化學(xué)染色的分析證實(shí)HK2-C3aR細(xì)胞株中C3aR表達(dá)水平較HK2非轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞高(2.33±0.45 vs 1.00±0.09,P0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建了C3aR慢病毒表達(dá)載體和過表達(dá)C3aR的人腎小管上皮細(xì)胞株,為進(jìn)一步研究C3aR過表達(dá)在人腎小管上皮細(xì)胞中的病理意義提供了很好的細(xì)胞模型,也為進(jìn)一步開展C3aR在其他細(xì)胞中的生理、病理意義創(chuàng)造了條件。
【作者單位】： 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心解放軍腎臟病研究所;
【關(guān)鍵詞】： CaR 慢病毒 腎小管上皮細(xì)胞 過表達(dá)
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81370828)
【分類號】：R692
【正文快照】： 0引言C3aR(又稱C3aR1)是補(bǔ)體C3裂解產(chǎn)物C3a的受體。在各種途徑的補(bǔ)體活化過程中,C3被C3轉(zhuǎn)化酶切割成C3b(大片段)和C3a(小片段)。C3b進(jìn)一步參與補(bǔ)體活化的級聯(lián)反應(yīng),C3a則被釋放出來。長期以來,C3a主要作為一種重要的促炎因子而為人們所認(rèn)識[1-4]。C3a通過激活C3aR趨化和激活白

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