本文關(guān)鍵詞：肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白介導(dǎo)脂肪酸通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑引起人近端小管上皮細(xì)胞凋亡

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【摘要】：目的:蛋白尿是慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease,CKD)的共同表現(xiàn),大量蛋白尿可引起腎小管及間質(zhì)的損傷和炎癥。而與白蛋白(albumin,Alb)結(jié)合的游離脂肪酸(free fat acids,FFAs)通過(guò)脂毒性,引起細(xì)胞功能障礙和損傷,參與了腎間質(zhì)損傷的過(guò)程。已有研究表明飽和脂肪酸棕櫚酸(Palmitic acids,PA)可誘導(dǎo)非脂肪細(xì)胞的損傷和凋亡。脂毒性包含了多種應(yīng)激反應(yīng),如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。但持久強(qiáng)烈的ERS會(huì)通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡途徑(ER-associated death),引起細(xì)胞凋亡。肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(liver-type fatty acid binding protein,L-FABP/FABP1)是脂肪酸結(jié)合蛋白家族一員,人腎近曲小管上皮細(xì)胞表達(dá)。尿L-FABP被認(rèn)為與腎小管間質(zhì)損傷密切相關(guān),是監(jiān)測(cè)CKD進(jìn)展的標(biāo)志物之一。本課題前期研究表明,油酸(Oleic acids,OA)誘導(dǎo)L-FABP表達(dá)和ERS,并導(dǎo)致HK-2細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步探討L-FABP與ERS之間的關(guān)系,本研究比較沉默HK-2細(xì)胞L-FABP前后,高PA和OA干預(yù)下的HK-2細(xì)胞,ERS相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,試圖明確L-FABP在FFA通過(guò)ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用,為臨床FFAs引起腎小管細(xì)胞凋亡提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1實(shí)驗(yàn)分組:⑴HK-2細(xì)胞隨機(jī)分為Control,高棕櫚酸(PA),高油酸(OA)和高蛋白(Alb)干預(yù)組。⑵HK-2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染sh NC或sh L-FABP后,分別給予高PA、OA和Alb干預(yù),并設(shè)立對(duì)照組sh NC、和sh L-FABP。具體實(shí)驗(yàn)分組如下。2 MTT法確定HK-2細(xì)胞50%生存率的PA濃度;3 Western blot法確定PA、OA干預(yù)HK-2細(xì)胞時(shí)間;4觀察PA、OA和Alb干預(yù)對(duì)L-FABP、HK-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白及凋亡蛋白表達(dá)的影響;5觀察轉(zhuǎn)染sh L-FABP質(zhì)粒后,PA、OA和Alb干預(yù)對(duì)HK-2細(xì)胞中的L-FABP、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白及凋亡蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1確定PA對(duì)HK-2細(xì)胞的干預(yù)濃度不同濃度PA干預(yù)HK-2細(xì)胞24h,發(fā)現(xiàn)PA濃度為200μmol/L HK-2細(xì)胞生存率為40%,接近50%。故選取PA濃度200μmol/L為干預(yù)濃度。2 PA干預(yù)HK-2細(xì)胞L-FABP的表達(dá)變化PA分別干預(yù)HK-2細(xì)胞3h,6h,12h,24h和48h的結(jié)果顯示:與干預(yù)前比較,3h,6h和12h L-FABP蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,24h表達(dá)達(dá)到峰值,48h表達(dá)減少。3 OA干預(yù)HK-2細(xì)胞L-FABP的表達(dá)變化OA分別干預(yù)HK-2細(xì)胞3h,6h,12h,24h和48h的結(jié)果顯示:與干預(yù)前比較,12h,24h和48h L-FABP蛋白表達(dá)增加,但24h達(dá)到峰值。4 PA、OA和Alb干預(yù)對(duì)HK-2細(xì)胞L-FABP蛋白表達(dá)的影響OA組和PA組L-FABP表達(dá)均高于正常對(duì)照組,Alb組與Control組無(wú)明顯區(qū)別。5 PA、OA和Alb干預(yù)對(duì)HK-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白及凋亡蛋白表達(dá)的影響OA組和PA組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)GRP78、CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3的表達(dá)均高于Control組;Alb組與Control組無(wú)明顯區(qū)別。6 sh L-FABP質(zhì)粒下調(diào)HK-2細(xì)胞中的L-FABP蛋白表達(dá)水平。熒光結(jié)果顯示,sh NC組和sh L-FABP組均可捕獲質(zhì)粒所攜帶的綠色熒光。與Control組相比,sh L-FABP組HK-2細(xì)胞的L-FABP蛋白的表達(dá)水平明顯降低。7 sh L-FABP質(zhì)粒下調(diào)PA和OA誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的高表達(dá)。⑴PA+sh NC組與sh NC組相比較,GRP78、PERK和p-PERK蛋白的表達(dá)水平明顯增高。敲低L-FABP后,PA+sh L-FABP組與PA+sh NC組相比較,GRP78、PERK、p-PERK蛋白的表達(dá)水平明顯降低。⑵OA+sh NC組與sh NC組相比較,GRP78、PERK和p-PERK蛋白的表達(dá)水平明顯增高。敲低L-FABP后,OA+sh L-FABP組與OA+sh NC組相比較,GRP78、PERK、p-PERK蛋白的表達(dá)水平明顯降低。⑶Alb+sh NC組與sh NC組相比較,PERK蛋白的表達(dá)水平有所增高,GRP78和p-PERK蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。敲低L-FABP后,Alb+sh L-FABP組與Alb+sh NC組相比較,PERK和p-PERK蛋白的表達(dá)水平有所下降,GRP78蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。8 sh L-FABP質(zhì)粒下調(diào)PA和OA誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡蛋白的高表達(dá)。⑴PA+sh NC組與sh NC組相比較,CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3蛋白的表達(dá)水平明顯增高。敲低L-FABP后,PA+sh L-FABP組與PA+sh NC組相比較,CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。⑵OA+sh NC組與sh NC組相比較,CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3蛋白的表達(dá)水平明顯增高。敲低L-FABP后,OA+sh L-FABP組與OA+sh NC組相比較,CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。⑶Alb+sh NC組與sh NC組相比較CHOP、Caspase3和CleaveCaspase3蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯增高。敲低L-FABP后,Alb+sh L-FABP組與Alb+sh NC組相比較,CHOP、Caspase3蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯下調(diào),Cleave Caspase3蛋白表達(dá)水平有所下調(diào)。結(jié)論:1 PA和OA上調(diào)HK-2細(xì)胞L-FABP蛋白,ERS相關(guān)蛋白以及ER相關(guān)凋亡蛋白表達(dá),這一結(jié)果證實(shí)OA和PA可誘導(dǎo)L-FABP蛋白表達(dá),ERS和ER相關(guān)的凋亡的發(fā)生。2沉默HK-2細(xì)胞的L-FABP,PA和OA干預(yù)上調(diào)的ERS相關(guān)蛋白以及ER相關(guān)凋亡蛋白有意義降低,證實(shí)L-FABP參與了FFAs誘導(dǎo)的ERS,并最終激活細(xì)胞ERS相關(guān)凋亡的發(fā)生。3高蛋白干預(yù)不能上調(diào)HK-2細(xì)胞L-FABP的表達(dá);無(wú)論L-FABP沉默與否,與對(duì)照組比較,高蛋白干預(yù)也不上調(diào)ERS相關(guān)蛋白以及ER相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá),在細(xì)胞學(xué)水平證實(shí)蛋白尿中導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷和凋亡的主要成份是FFAs而不是白蛋白。
【關(guān)鍵詞】：棕櫚酸 油酸 HK-2細(xì)胞 肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 凋亡
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R692
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 英文縮寫(xiě)12-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-25
• 結(jié)果25-27
• 附圖27-37
• 討論37-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-47
• 綜述47-59
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 致謝59-60
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷60

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本文編號(hào)：840430