本文關(guān)鍵詞：人前列腺癌細(xì)胞株核酸適配體篩選及初步應(yīng)用研究

  更多相關(guān)文章： Cell-SELEX 前列腺癌 核酸適配體 PC-3M-1E8細(xì)胞株

【摘要】：前列腺癌(Prostate Carcinoma,PCa)是一種嚴(yán)重威脅男性健康的常見惡性腫瘤,其發(fā)病率位居全球男性惡性腫瘤的第二位,近年來,其發(fā)病率在全球仍在急劇增加。前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)及早期治療,可以極大提高患者的治愈率,有效延長患者的壽命。目前,針對前列腺癌的早期診斷方法主要是建立在直腸指檢、影像學(xué)檢查、腫瘤標(biāo)記物檢查和穿刺活檢等基礎(chǔ)上,存在發(fā)現(xiàn)不及時、檢測范圍局限、易損傷正常組織、易與其它病癥相混淆等缺陷,難以對前列腺癌實現(xiàn)早期診斷。因此,篩選獲取一種特異性前列腺癌細(xì)胞的新型分子識別探針,建立一種簡單、迅速、靈敏、特異性強(qiáng)的分子識別早期診斷技術(shù),對前列腺癌的早期診斷和早期治療具有非常重要的意義。Cell-SELEX技術(shù)是近年發(fā)展起來的以完整腫瘤細(xì)胞為靶標(biāo)的篩選技術(shù),能從不同類型腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞中篩選獲得特異性識別靶細(xì)胞的核酸適配體探針,篩選得到的核酸適配體可結(jié)合天然狀態(tài)的靶分子,直接用于識別、檢測細(xì)胞,對癌癥早期診斷和分型、腫瘤標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)及腫瘤的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制的研究提供了新的契機(jī),在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著非常重要的作用。本文基于Cell-SELEX技術(shù),以人前列腺高轉(zhuǎn)移癌為靶細(xì)胞,人前列腺低轉(zhuǎn)移癌為對照細(xì)胞,在未知細(xì)胞表面靶標(biāo)的情況下,篩選出一種能高親和力高特異性識別人前列腺癌細(xì)胞株的核酸適配體。具體內(nèi)容如下:1.人前列腺癌PC-3M-1E8細(xì)胞株核酸適配體的篩選以人前列腺高轉(zhuǎn)移癌PC-3M-1E8細(xì)胞株為靶細(xì)胞,人前列腺低轉(zhuǎn)移癌PC-3M-2B4細(xì)胞株為對照細(xì)胞,利用Cell-SELEX技術(shù),通過增加洗滌次數(shù),增加反篩細(xì)胞數(shù)量等手段,不斷提高篩選過程中的篩選壓力,從而提高篩選的效率,最后經(jīng)過12輪篩選,獲得了飽和富集篩選文庫。通過對篩選文庫克隆測序和同源性分析,獲得了4條能夠同時結(jié)合PC-3M-1E8和PC-3M-2B4兩細(xì)胞株的核酸適配體。2.人前列腺癌細(xì)胞株核酸適配體的性質(zhì)考察及初步應(yīng)用研究隨后對所獲得的核酸適配體進(jìn)行了性質(zhì)分析研究,通過流式細(xì)胞術(shù)考察了細(xì)胞特異性、平衡解離常數(shù)、溫度穩(wěn)定性等。實驗結(jié)果表明,核酸適配體具有特異性強(qiáng)、親和力高、溫度穩(wěn)定性好等特點。另外,還運(yùn)用Mfold軟件分析了核酸適配體的二級結(jié)構(gòu),根據(jù)二級結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)的優(yōu)化,得到一條僅有51 nt的優(yōu)化后序列C1,其平衡解離常數(shù)約為10 n M;以及經(jīng)蛋白酶處理后,根據(jù)核酸適配體與細(xì)胞的結(jié)合情況,初步推測細(xì)胞表面的靶分子很可能是一種膜蛋白,為后續(xù)前列腺癌細(xì)胞表面的特異性腫瘤標(biāo)記物的研究與釣取奠定了實驗基礎(chǔ),并有望應(yīng)用到前列腺癌的早期診斷治療中。
【關(guān)鍵詞】：Cell-SELEX 前列腺癌 核酸適配體 PC-3M-1E8細(xì)胞株
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 本文所用英文縮略詞表11-12
• 第1章 緒論12-31
• 1.1 前列腺癌12-16
• 1.1.1 前列腺癌的概述12-14
• 1.1.2 前列腺癌的診斷研究進(jìn)展14-16
• 1.2 SELEX技術(shù)16-22
• 1.2.1 SELEX技術(shù)簡介16-18
• 1.2.2 SELEX技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀18-22
• 1.3 核酸適配體在腫瘤細(xì)胞檢測及成像中的應(yīng)用22-29
• 1.3.1 核酸適配體性質(zhì)22-23
• 1.3.2 核酸適配體在腫瘤細(xì)胞檢測中的應(yīng)用23-26
• 1.3.3 核酸適配體在腫瘤細(xì)胞成像中的應(yīng)用26-29
• 1.4 本論文擬開展的工作29-31
• 第2章 人前列腺癌細(xì)胞株核酸適配體的篩選31-53
• 2.1 前言31
• 2.2 實驗部分31-41
• 2.2.1 試劑和儀器31-34
• 2.2.2 溶液的配制34
• 2.2.3 細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代及細(xì)胞懸液的配置34-35
• 2.2.4 PCR條件的優(yōu)化35-36
• 2.2.5 瓊脂糖凝膠電泳及成像36-37
• 2.2.6 前列腺癌細(xì)胞株核酸適配體的篩選37-40
• 2.2.7 篩選進(jìn)程的監(jiān)測40
• 2.2.8 克隆測序及序列分析40
• 2.2.9 序列特異性考察40-41
• 2.2.10 序列親和力考察41
• 2.2.11 激光共聚焦驗證41
• 2.3 結(jié)果與討論41-52
• 2.3.1 引物的設(shè)計及PCR條件的優(yōu)化41-43
• 2.3.2 篩選條件的選擇43-44
• 2.3.3 篩選過程的表征44-45
• 2.3.4 篩選文庫的進(jìn)化表征及終點判斷45-47
• 2.3.5 克隆測序結(jié)果及序列分析47-49
• 2.3.6 核酸適配體的特異性考察49-50
• 2.3.7 核酸適配體的親和力考察50-52
• 2.3.8 激光共聚焦驗證結(jié)果52
• 2.4 小結(jié)52-53
• 第3章 人前列腺癌細(xì)胞株核酸適配體的性質(zhì)考察及初步應(yīng)用研究53-60
• 3.1 前言53
• 3.2 實驗部分53-55
• 3.2.1 試劑和儀器53-54
• 3.2.2 優(yōu)化后序列的性質(zhì)考察54
• 3.2.3 溫度對核酸適配體結(jié)合能力的影響54-55
• 3.2.4 酶對核酸適配體結(jié)合情況的影響55
• 3.3 結(jié)果與討論55-59
• 3.3.1 核酸適配體的序列優(yōu)化55-56
• 3.3.2 優(yōu)化后序列的性質(zhì)考察56-58
• 3.3.3 溫度對核酸適配體結(jié)合能力的影響58
• 3.3.4 酶對核酸適配體結(jié)合情況的影響58-59
• 3.4 小結(jié)59-60
• 結(jié)論60-61
• 附篇 基于GO-淬滅的熒光aptasensor用于肝癌細(xì)胞SMMC-7721的高靈敏檢測61-68
• 1.1 前言61
• 1.2 實驗部分61-63
• 1.3 結(jié)果與討論63-67
• 1.4 小結(jié)67-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 附錄A 攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文75-76
• 致謝76-77

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本文編號：833604