發(fā)布時(shí)間：2017-09-01 00:41

  本文關(guān)鍵詞：二甲雙胍通過(guò)COX2-PGE2-STAT3抑制膀胱癌干細(xì)胞的增殖以及膀胱癌的進(jìn)展

  更多相關(guān)文章： 二甲雙胍 腫瘤干細(xì)胞 環(huán)氧化酶2 前列腺素E2 STAT3信號(hào)通路

【摘要】：目的腫瘤干細(xì)胞已經(jīng)證實(shí)與腫瘤的發(fā)生、分化、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、化學(xué)治療藥物的抵抗有關(guān)。二甲雙胍是最常見(jiàn)的降血糖藥物,已經(jīng)證實(shí)可通過(guò)不同的通路起到抗腫瘤的作用,但是二甲雙胍抑制膀胱癌干細(xì)胞的作用還不清楚。我們希望通過(guò)對(duì)膀胱癌動(dòng)物模型和細(xì)胞模型的研究,探究二甲雙胍對(duì)膀胱癌干細(xì)胞增殖以及膀胱癌進(jìn)展的影響。方法1.大鼠分為三組:對(duì)照組(經(jīng)尿道灌注檸檬酸鈉緩沖液+普通飲水)、MNU組(經(jīng)尿道灌注MNU+普通飲水)、MET組(經(jīng)尿道灌注MNU+1g/L二甲雙胍作為飲水),每三周灌注2.5mg MNU一次,飲水每日更換。三組分別于第三周(30只)、第六周(26只)、第十二周(44只)處死相應(yīng)分組的SD大鼠,測(cè)量他們的體重、血糖,留取膀胱組織,膀胱組織用10%的福爾馬林固定24小時(shí),然后進(jìn)行石蠟包埋。石蠟組織塊連續(xù)切片,隨后進(jìn)行常規(guī)HE染色;分別進(jìn)行抗Ki-67抗體、抗Bcl-2抗體、抗CK20抗體、抗CK14抗體、抗OCT3/4抗體、抗COX2抗體、抗p-STAT3抗體免疫組化染色。2.采用MTT法研究20 mM二甲雙胍對(duì)T24、RT4膀胱癌細(xì)胞增殖的影響;采用Western blot法研究0mM、1mM、5mM、10 mM、20 mM二甲雙胍對(duì)T24、RT4膀胱癌細(xì)胞的Bcl-2、Cyclin D1、AMPK、p-AMPK蛋白的影響;流式細(xì)胞學(xué)研究0mM、1mM、5m M、10 mM、20 m M二甲雙胍對(duì)T24膀胱癌細(xì)胞周期及凋亡的影響。3.采用ELISA法檢測(cè)0mM、1m M、5mM、10mM、20mM二甲雙胍對(duì)T24膀胱癌細(xì)胞生成PGE2的影響;采用Western blot法檢測(cè)0m M、1m M、5mM、10 m M、20 mM二甲雙胍、塞來(lái)昔布、外源性PGE2以及si COX2處理T24膀胱癌細(xì)胞后,對(duì)COX2、p-STAT3、STAT3、CK14、OCT3/4蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果1.第三周膀胱組織HE染色對(duì)照組無(wú)異常,MNU組輕度非典型增生與MET組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(MNU組10只大鼠vs MET組10只大鼠:24 vs 28,P=0.466),MNU組的中、重度非典型增生比MET組顯著增多(MNU組10只大鼠vs MET組10只大鼠:36vs10,p=0.007)。第六周膀胱組織he染色,對(duì)照組未見(jiàn)異常,mnu組輕度非典型增生比met組少(mnu組8只大鼠vsmet組8只大鼠:15vs29,p=0.026),mnu組的中、重度非典型增生比met組顯著增多(mnu組8只大鼠vsmet組8只大鼠30vs5,p=0.02),且mnu組有三處cis,而met組未發(fā)現(xiàn)cis。第十二周膀胱組織he染色,對(duì)照組未見(jiàn)異常,mnu組膀胱乳頭狀癌比met組少(mnu組14只大鼠vsmet組20只大鼠:19vs53,p=0.03),mnu組的膀胱浸潤(rùn)性癌比met組顯著增多(mnu組14只大鼠vsmet組20只大鼠49vs46,p=0.034)。2.t24、rt4膀胱癌細(xì)胞給予20mm的二甲雙胍處理、對(duì)照組不作特殊處理,分別處理5天,mtt檢測(cè)細(xì)胞活性,處理組較未處理組細(xì)胞活性下降、生長(zhǎng)緩慢,且在處理24小時(shí)后開(kāi)始出現(xiàn)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)。一磷酸腺苷蛋白激活酶(ampk)已經(jīng)確認(rèn)是二甲雙胍的分子靶點(diǎn),t24細(xì)胞不同濃度的二甲雙胍處理后westernblot分析其p-ampk蛋白表達(dá)增加而總的ampk蛋白無(wú)明顯變化,t24、rt4細(xì)胞bcl-2、cyclind1蛋白表達(dá)降低且表現(xiàn)出劑量依賴性。t24膀胱癌細(xì)胞不加血清饑餓24小時(shí)后分別給予0mm、1mm、5mm、10mm、20mm二甲雙胍處理24小時(shí),進(jìn)行周期和凋亡分析,二甲雙胍處理組g1/s期細(xì)胞數(shù)增加,而且凋亡細(xì)胞的數(shù)量增多。對(duì)第三周、第六周、第十二周大鼠膀胱組織進(jìn)行抗ki-67抗體、抗bcl-2抗體的免疫組化染色結(jié)果,二甲雙胍處理組不僅染色強(qiáng)度較未處理組弱而且染色細(xì)胞數(shù)也較少。3.為了研究二甲雙胍是否對(duì)不同的祖細(xì)胞可以發(fā)揮不同的效應(yīng),我們研究了兩種干細(xì)胞標(biāo)志物即ck14和oct3/4。我們對(duì)第三周、第六周、第十二周大鼠膀胱組織進(jìn)行抗ck14抗體、抗oct3/4抗體的免疫組化染色結(jié)果,二甲雙胍處理組染色強(qiáng)度較未處理組弱,染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也較未處理組少,同時(shí)ck20染色強(qiáng)度增加和陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)增加。這就表明二甲雙胍可以選擇性抑制浸潤(rùn)性病變而對(duì)乳頭狀病變無(wú)影響。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明二甲雙胍可抑制基底細(xì)胞的增殖從而抑制早期原位癌、浸潤(rùn)性腫瘤的進(jìn)展。4.為了探討研究二甲雙胍抑制ck14、oct3/4陽(yáng)性細(xì)胞增殖的機(jī)制,我們研究二甲雙胍在pge2合成酶cox2中的作用。對(duì)第三周、第六周、第十二周大鼠膀胱組織進(jìn)行抗cox2抗體的免疫組化染色結(jié)果,在每個(gè)時(shí)間點(diǎn),二甲雙胍處理組染色強(qiáng)度都較未處理組弱,染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也較未處理組少。t24膀胱癌細(xì)胞給予0mm、1mm、5mm、10mm、20mm二甲雙胍處理24小時(shí)后進(jìn)行westernblot分析cox2蛋白,結(jié)果表明二甲雙胍劑量性依賴地抑制cox2的表達(dá),與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。pge2作為cox2的催化產(chǎn)物,elisa結(jié)果也證實(shí)了:二甲雙胍確實(shí)可以抑制pge2的合成。有研究表明,在直腸癌中pge2可以調(diào)控jak/stat3信號(hào)通路;同時(shí)也有研究證實(shí)膀胱癌中STAT3不僅可以調(diào)控CK14陽(yáng)性干細(xì)胞的增殖,也可以導(dǎo)致浸潤(rùn)性膀胱癌的進(jìn)展。因而我們推測(cè)二甲雙胍抑制膀胱癌的進(jìn)展是通過(guò)COX2/PGE2/STAT3這一通路。體內(nèi)原位膀胱癌SD大鼠模型中,P-STAT3的免疫組化結(jié)果證實(shí)了二甲雙胍抑制STAT3的活化。同樣,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),二甲雙胍劑量依賴性地抑制了p-STAT3蛋白而總STAT3蛋白無(wú)變化,與此同時(shí),也下調(diào)了CK14和OCT3/4這兩個(gè)干性指標(biāo)。這些結(jié)果暗示了:二甲雙胍通過(guò)COX2/STAT3通路抑制膀胱癌的進(jìn)展。為證實(shí)這一通路,我們用COX2特異性的抑制劑塞來(lái)昔布(或二甲雙胍)來(lái)處理T24細(xì)胞,Western blot結(jié)果證實(shí)塞來(lái)昔布特異性地抑制COX2后,相應(yīng)的P-STAT3、CK14和OCT3/4等下游蛋白水平也被下調(diào)與二甲雙胍的效應(yīng)一致。進(jìn)一步我們用si RNA技術(shù)敲低COX2,si COX2-1、siCOX 2-3能敲低COX2從而抑制p-STAT3、CK14、OCT3/4蛋白的表達(dá),總的STAT3蛋白未見(jiàn)改變,其中siCOX 2-2未敲低COX2的原因不太清楚。為研究PGE2在這個(gè)通路中的影響,我們給予外源性的PGE2處理T24膀胱癌細(xì)胞,Western blot結(jié)構(gòu)表明p-STAT3、CK14、OCT3/4蛋白的表達(dá)升高,因此,這些結(jié)果表明二甲雙胍能通過(guò)下調(diào)COX2,從而抑制COX2/PGE2/STAT3信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制膀胱癌CK14+干細(xì)胞的增殖。結(jié)論1.二甲雙胍雖然不能抑制原位膀胱癌模型膀胱腫瘤的形成,但能減緩浸潤(rùn)性膀胱癌形成的時(shí)間以及減少浸潤(rùn)性病變的數(shù)量;2.二甲雙胍可以抑制膀胱癌干細(xì)胞的增殖、促進(jìn)膀胱癌干細(xì)胞的凋亡;3.二甲雙胍可下調(diào)COX2和PGE2達(dá)到抑制STAT3的磷酸化和活化。綜上所訴二甲雙胍通過(guò)COX2/PGE2/STAT3抑制膀胱癌干細(xì)胞的增殖以及膀胱癌的進(jìn)展
【關(guān)鍵詞】：二甲雙胍 腫瘤干細(xì)胞 環(huán)氧化酶2 前列腺素E2 STAT3信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.14
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 二甲雙胍抑制SD雌性大鼠原位膀胱癌模型的進(jìn)展15-27
• 2.1 材料和方法15-19
• 2.2 結(jié)果19-26
• 2.3 討論26-27
• 第三章 二甲雙胍通過(guò)COX2/PGE2/STAT3信號(hào)通路抑制膀胱癌干細(xì)胞體外增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡27-39
• 3.1 材料和方法27-34
• 3.2 結(jié)果34-37
• 3.3 討論37-39
• 全文結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-45
• 文獻(xiàn)綜述 膀胱癌的起源45-53
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章53-54
• 致謝54

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本文編號(hào)：768937