本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)RNA干擾UBE2C基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞株作用的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 慢病毒 RNA干擾 前列腺癌 細(xì)胞增殖 細(xì)胞侵襲

【摘要】：目的探討RNA干擾慢病毒重組顆粒(LV-sh RNA-UBE2C)介導(dǎo)人類泛素偶聯(lián)酶E2C(ubiquitin-conjugating enzyme E2C,UBE2C)基因沉默后,對(duì)人前列腺癌細(xì)胞株UBE2C基因的表達(dá)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲及遷移、克隆形成的影響。方法1.使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR(real-time reverse transcription and polymerase Chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)UBE2Cm RNA在前列腺癌LNCap、PC3、DU145和C4-2四種細(xì)胞株的表達(dá)水平。以蛋白印跡(Western blot)技術(shù)檢測(cè)UBE2C蛋白在LNCap、PC3、DU145、C4-2四種前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平,并篩選實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞。2.根據(jù)RNAi的設(shè)計(jì)原則,進(jìn)行設(shè)計(jì)合成特異性的靶向UBE2C的sh RNA表達(dá)載體(LV-sh RNA-UBE2C)及陰性對(duì)照組LV-sh RNA-NC,并且有美國(guó)Gene Copoeia公司包裝合成慢病毒顆粒。3.將人前列腺癌PC3及DU145細(xì)胞株分別隨機(jī)分為3組:LV-sh RNA-UBE2C實(shí)驗(yàn)組、LV-sh RNA-NC陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組LV-sh RNA-UBE2C基因沉默組慢病毒顆粒進(jìn)行感染PC3及DU145細(xì)胞細(xì)胞;LV-sh RNA-NC陰性對(duì)照組為對(duì)照慢病毒顆粒LV-sh RNA-NC感染PC3及DU145細(xì)胞;空白對(duì)照組為PC3及DU145細(xì)胞株常規(guī)的進(jìn)行培養(yǎng),不進(jìn)行任何的處理。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和蛋白印跡方法來檢測(cè)UBE2C m RNA及蛋白的表達(dá)水平來評(píng)價(jià)慢病毒顆粒的干擾的效果。4.應(yīng)用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞在體外的增殖能力,Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲及遷移能力,平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的克隆形成,流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry,FCM)分別檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。結(jié)果1.RT-PCR結(jié)果顯示在LNCap、PC3、DU145和C4-2四種人前列腺癌細(xì)胞中UBE2Cm RNA均有表達(dá),并且在PC3及DU145細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較高,其中在PC3細(xì)胞內(nèi)表達(dá)最高。2.蛋白印跡結(jié)果顯示人前列腺癌PC3及DU145細(xì)胞中UBE2C基因表達(dá)水平在四種細(xì)胞中的表達(dá)水平中顯示較高,其中在PC3細(xì)胞內(nèi)表達(dá)最高3.RT-PCR及蛋白印跡法結(jié)果顯示:在PC3及DU145細(xì)胞中,實(shí)驗(yàn)組LV-sh RNA-UBE2C和陰性對(duì)照組LV-sh RNA-NC及空白對(duì)照組比較,UBE2C m RNA及蛋白的表達(dá)水平下調(diào),差別顯著(p0.05)。4.MTT法顯示:LV-sh RNA-UBE2C組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48、72小時(shí)的OD490值均低于LV-sh RNA-NC陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組,差別顯著(p0.05)。5.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)法顯示:LV-sh RNA-UBE2C組的克隆形成能力明顯低于LV-sh RNA-NC陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組,LV-sh RNA-UBE2C實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制(p0.05)。6.Transwell實(shí)驗(yàn)顯示LV-sh RNA-UBE2C組細(xì)胞遷移及侵襲能力較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組LV-sh RNA-NC下降(p0.05)。7.流式細(xì)胞技術(shù)顯示:LV-sh RNA-UBE2C實(shí)驗(yàn)組較LV-sh RNA-NC陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組G1期延長(zhǎng),S期縮短,差別顯著(p0.05)。結(jié)論1.慢病毒介導(dǎo)的UBE2C基因干擾能穩(wěn)定有效地表達(dá)于人前列腺癌細(xì)胞,篩選出能穩(wěn)定干擾UBE2C基因表達(dá)的sh RNA序列和試驗(yàn)用的人前列腺癌PC3及DU145細(xì)胞株。2.UBE2C慢病毒干擾載體可有效沉默人前列腺癌PC3及DU145細(xì)胞UBE2C基因,下調(diào)人前列腺癌PC3及DU145細(xì)胞UBE2C基因的表達(dá)。針對(duì)UBE2C的sh RNA慢病毒顆粒能夠有效的阻斷人前列腺癌PC3及DU145細(xì)胞株中UBE2Cm RNA及蛋白的表達(dá),并以此抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,下調(diào)細(xì)胞的侵襲、遷移能力,降低細(xì)胞的克隆形成能力。
【關(guān)鍵詞】：慢病毒 RNA干擾 前列腺癌 細(xì)胞增殖 細(xì)胞侵襲
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說明10-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、慢病毒介導(dǎo)RNAi對(duì)人前列腺癌細(xì)胞UBE2C表達(dá)的影響15-40
• 1 材料和方法15-32
• 1.1 主要儀器及試劑15-19
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法19-32
• 1.2.1 慢病毒顆粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、重組19-21
• 1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及相關(guān)操作21-22
• 1.2.3.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)22-25
• 1.2.4.蛋白印跡法檢測(cè)25-29
• 1.2.5.慢病毒液的滴度測(cè)定29-30
• 1.2.6.細(xì)胞轉(zhuǎn)染30-32
• 1.2.7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32
• 2 結(jié)果32-36
• 3 討論36-39
• 4 小結(jié)39-40
• 二、下調(diào)UBE2C表達(dá)影響人前列腺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為40-53
• 1 材料和方法40-44
• 1.1 材料40
• 1.2 主要試劑40
• 1.3 方法40-44
• 1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)操作40
• 1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染40-41
• 1.3.3 慢病毒轉(zhuǎn)染41
• 1.3.4 MTT法分析細(xì)胞增殖41-42
• 1.3.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成42-43
• 1.3.6 Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)43
• 1.3.7 Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)43-44
• 1.3.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期44
• 1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析44
• 2 結(jié)果44-50
• 3 討論50-52
• 4 小結(jié)52-53
• 全文結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 發(fā)表論文57-58
• 綜述 UBE2C與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展58-64
• 綜述發(fā)表文獻(xiàn)62-64
• 致謝64-65
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷65

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本文編號(hào)：758195