本文關鍵詞：褪黑素緩解白消安造成的小鼠精原干細胞氧化應激和凋亡損傷機理的研究

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【摘要】：最新的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)表明,中國每年新增的白血病患者,兒童已經(jīng)占50%左右,這個比例正在逐年增加。在兒童惡性腫瘤中,白血病已經(jīng)居于首位,且多發(fā)生于男性未成年的兒童。傳統(tǒng)的化療藥物白消安已經(jīng)廣泛的應用于造血干細胞移植預處理,但是這種細胞周期非特異性的烷化劑會導致長期服用的男性出現(xiàn)不育的癥狀。隨著治療方法的改進,許多兒童和青少年白血病患者都可生存至成年并有生育要求。目前,對于不同劑量白消安導致睪丸生精障礙和白消安停藥后恢復的中、長期研究資料匾乏。白消安在實驗中被廣泛的應用于制備精原干細胞移植受體。其利用白消安清除內(nèi)源性的生精細胞,再移植外源性的精原干細胞到受體睪丸中,從而研究精子發(fā)生等一些列實驗。不同物種使用白消安的劑量具有很大的差異:小鼠腹腔注射劑量約為20-40 mg/kg,大鼠腹腔注射劑量約為15 mg/kg,8-12 mg/kg劑量的白消安腹腔注射后很有可能使得獼猴生精功能不可恢復。腹腔注射白消安后,機體通過體液循環(huán)將其運送到睪丸組織,導致睪丸曲細精管中生殖細胞的發(fā)生過程受到損傷。如果未損傷精原干細胞,停止注射白消安后,經(jīng)過8-10周,睪丸中精子的再生功能就可以重新啟動,生殖細胞即可進行正常的減數(shù)分裂。因此,研究白消安對睪丸中生殖細胞損傷的機理以及減少其副作用是非常有必要的。本研究采用ICR小鼠作為研究對象,腹腔注射白消安,建立無精癥小鼠模型,從而研究白消安的生殖毒理機制。首先,構建好模型后,通過形態(tài)學、組織學、免疫熒光染色、CCK-8細胞活力檢測確認白消安首先影響睪丸中精原干細胞,其次為精母細胞,且這種影響呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。進一步采用TUNEL染色、流式凋亡檢測、流式細胞周期檢測、WB、PCR等手段確定白消安激活細胞內(nèi)p38信號通路,從而引起細胞凋亡。在機理研究上,我們用流式細胞術檢測了細胞內(nèi)ROS水平,發(fā)現(xiàn)白消安加入后,細胞內(nèi)H2O2、O2-水平大幅度上升,且MnSOD、SIRT1等清除氧自由基的相關基因的表達明顯受到抑制。通過檢測GSH/GSSG的比率,白消安能夠對GSH產(chǎn)生毀滅性的消耗,極大的破壞細胞內(nèi)ROS平衡。JC-1染色發(fā)現(xiàn),失衡的ROS會影響線粒體的膜電位,從而引發(fā)細胞凋亡。我們采用體內(nèi)實驗證實,褪黑素能夠有效的緩解白消安所致的小鼠睪丸細胞損傷,但是具有時間依賴性,已經(jīng)造成的損傷無法逆轉;體外實驗證實,褪黑素能夠有效地緩解白消安導致的細胞內(nèi)ROS失衡,從而減少細胞凋亡的比率。本實驗初步證明了白消安導致小鼠無精癥的機理,并且確定白消安會造成生殖細胞凋亡主要是通過破壞細胞內(nèi)ROS平衡,激活p38信號通路,而不是p53信號通路。同時也發(fā)現(xiàn)了褪黑素能夠有效地緩解白消安造成的細胞凋亡,挽救由于白消安所致的無精癥。為臨床上治療白消安并發(fā)癥提供了一定的指導意義。
【關鍵詞】：白消安 精原干細胞 褪黑素 氧化應激(ROS) 凋亡
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7;R698
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文獻綜述13-20
• 第一章 白消安和褪黑素在精原干細胞損傷中的研究進展13-20
• 1.1 精原干細胞與精子發(fā)生13-14
• 1.2 白消安研究進展14-16
• 1.2.1 白消安簡介14-15
• 1.2.2 白消安在臨床中的應用15
• 1.2.3 白消安與精子發(fā)生15-16
• 1.2.4 白消安與氧化應激16
• 1.3 抗白消安損傷藥物的研究進展16
• 1.4 褪黑素的研究進展16-20
• 1.4.1 褪黑素的抗氧化作用16-17
• 1.4.2 褪黑素受體及其信號通路17-19
• 1.4.3 褪黑素與雄性生殖19
• 1.4.4 褪黑素的應用19-20
• 試驗研究20-59
• 第二章 白消安對小鼠睪丸細胞的影響20-36
• 2.1 材料和方法20-28
• 2.1.1 實驗材料20
• 2.1.2 實驗試劑20-21
• 2.1.3 實驗儀器21
• 2.1.4 相關試劑配制方法21-23
• 2.1.5 白消安受體鼠的制備23
• 2.1.6 白消安處理后受體鼠睪丸形態(tài)學與睪體比的分析23
• 2.1.7 白消安處理后受體鼠睪丸組織學分析23-24
• 2.1.8 白消安處理后受體鼠睪丸組織特異性蛋白免疫熒光染色分析24
• 2.1.9 不同類型睪丸細胞經(jīng)白消安處理后細胞活力分析24-25
• 2.1.10 白消安處理后受體鼠睪丸組織懸液制備25
• 2.1.11 受體鼠睪丸懸液流式細胞術細胞周期、凋亡檢測分析25
• 2.1.12 受體鼠睪丸組織切片TUNEL凋亡檢測分析25-26
• 2.1.13 受體鼠睪丸組織定量檢測分析26-27
• 2.1.14 Western Blot檢測白消安對于C18-4 的影響27-28
• 2.1.15 穩(wěn)定性分析28
• 2.2 結果28-34
• 2.2.1 白消安會造成小鼠睪丸萎縮、睪體比下降28
• 2.2.2 白消安會造成小鼠精原細胞丟失28-29
• 2.2.3 白消安對小鼠睪丸細胞活力的影響具有時間、劑量依賴性29-30
• 2.2.4 白消安會造成小鼠睪丸細胞周期阻滯30-31
• 2.2.5 白消安會造成小鼠睪丸內(nèi)精原細胞凋亡31-32
• 2.2.6 白消安會造成小鼠睪丸細胞應激水平增高32-33
• 2.2.7 白消安造成細胞凋亡是通過p38-ERK通路33-34
• 2.3 討論34-35
• 2.4 小結35-36
• 第三章 褪黑素能夠緩解白消安引起的小鼠睪丸細胞凋亡36-49
• 3.1 材料和方法36-40
• 3.1.1 實驗材料36
• 3.1.2 實驗試劑36
• 3.1.3 實驗儀器36-37
• 3.1.4 實驗主要試劑配制方法37-38
• 3.1.5 褪黑素挽救白消安損傷模型的建立38
• 3.1.6 睪丸中褪黑素受體檢測38
• 3.1.7 褪黑素對于C18-4 細胞氧化應激相關基因的功能檢測38-39
• 3.1.8 褪黑素挽救白消安損傷模型小鼠睪丸組織學檢測39
• 3.1.9 褪黑素挽救白消安損傷模型小鼠睪丸中減數(shù)分裂檢測39-40
• 3.1.10 褪黑素緩解白消安對于C18-4 細胞毒性檢測40
• 3.1.11 數(shù)據(jù)及穩(wěn)定性分析40
• 3.2 結果40-48
• 3.2.1 小鼠睪丸中有褪黑素受體MT1、MT2的表達40-41
• 3.2.2 褪黑素能夠促進C18-4 細胞內(nèi)抗氧化基因的表達41-42
• 3.2.3 褪黑素能夠有效的挽救白消安注射1周后小鼠曲細精管中的細胞42-43
• 3.2.4 褪黑素能夠有效的挽救白消安注射2周后小鼠曲細精管中的細胞43-44
• 3.2.5 褪黑素不能夠有效的挽救白消安注射3周后小鼠曲細精管中的細胞44-45
• 3.2.6 褪黑素能夠有效的緩解白消安的細胞毒性45-46
• 3.2.7 褪黑素能夠抑制P38信號通路從而緩解白消安所導致的細胞凋亡46-48
• 3.3 討論48
• 3.4 小結48-49
• 第四章 褪黑素能夠通過保護線粒體抑制ROS從而緩解白消安的細胞毒性49-59
• 4.1 材料和方法49-52
• 4.1.1 實驗材料49
• 4.1.2 實驗試劑49
• 4.1.3 實驗儀器49
• 4.1.4 主要實驗溶液的配制49-50
• 4.1.5 褪黑素、白消安處理后細胞內(nèi)活性氧檢測50
• 4.1.6 褪黑素、白消安處理后細胞內(nèi)GSH/ GSSG檢測50-51
• 4.1.7 褪黑素、白消安處理后細胞內(nèi)線粒體膜電位檢測51-52
• 4.1.9 穩(wěn)定性分析52
• 4.2 結果52-57
• 4.2.1 褪黑素能夠有效的緩解白消安所導致的細胞內(nèi)ROS積累52-53
• 4.2.2 褪黑素能夠有效地保護細胞內(nèi)GSH的平衡53-54
• 4.2.3 褪黑素能夠有效的保護線粒體膜電位平衡54
• 4.2.4 褪黑素通過提高SIRT1、MnSOD的表達抑制白消安毒性54-57
• 4.3 討論57-58
• 4.4 小結58-59
• 結論59
• 創(chuàng)新點59
• 進一步研究課題59-60
• 參考文獻60-67
• 附錄67-71
• 縮略詞71-72
• 致謝72-73
• 作者簡介及攻讀碩士學位期間的主要研究成果73

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