本文關(guān)鍵詞：小鼠足細(xì)胞特異敲除核因子-κB受體活化因子對(duì)蛋白尿的影響

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【摘要】：研究背景隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,人民生活水平的提高,慢性腎臟病(CKD)已成為威脅人類健康的全球性公共健康問(wèn)題。有調(diào)查表明,在我國(guó),成年人中CKD患病率高達(dá)10.8%。而慢性腎臟病的特點(diǎn)是隱匿起病,逐漸進(jìn)展,不可逆轉(zhuǎn)。近幾年來(lái),我國(guó)每年進(jìn)入腎臟病終末期的患者人數(shù)依舊不斷攀升,因此,如何延緩CKD的進(jìn)展成為急需解決的一項(xiàng)醫(yī)療難題。大量研究表明,蛋白尿是影響CKD惡化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一,蛋白尿的水平將直接影響慢性腎臟疾病的預(yù)后,故如何降低蛋白尿水平具有重大的醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值。腎小球?yàn)V過(guò)屏障的功能和結(jié)構(gòu)與蛋白尿的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)聯(lián)系。腎小球?yàn)V過(guò)屏障由5層結(jié)構(gòu)組成：內(nèi)皮細(xì)胞表面膜結(jié)構(gòu),內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞窗孔,腎小球基底膜(GBM),足細(xì)胞下間隙和足細(xì)胞。足細(xì)胞足突之間的裂孔膜構(gòu)成了腎小球?yàn)V過(guò)的最后一道屏障。隨著認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步加深,越來(lái)越多的文獻(xiàn)指出,足細(xì)胞在參與蛋白尿的發(fā)生中占據(jù)了重要的地位。足細(xì)胞是位于腎小球臟層的上皮細(xì)胞。相鄰足細(xì)胞足突之間呈指狀交叉形成濾過(guò)的裂孔。裂隙間由裂孔隔膜構(gòu)成,足突之間的裂孔膜構(gòu)成了腎小球?yàn)V過(guò)的最后一道屏障。只有小分子物質(zhì)能夠通過(guò)裂孔隔膜,而蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)不能通過(guò)。足細(xì)胞頂膜區(qū)覆蓋著帶有負(fù)電荷的podocalyxin,它參與了維持腎小球?yàn)V過(guò)膜負(fù)電荷屏障。而足細(xì)胞特殊結(jié)構(gòu)的維持有賴于微絲肌動(dòng)蛋白為主的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)以及足細(xì)胞中特異性表達(dá)的蛋白分子,包括以nephrin為代表的SD膜蛋白；以α3β1整合素為代表的基底膜-足細(xì)胞連接到膜蛋白；以及以podocalyxin為代表的足細(xì)胞頂端蛋白。足細(xì)胞的受損會(huì)破壞正常的腎小球?yàn)V過(guò)屏障,導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。在人類疾病中,微小病變型腎病、膜性腎病及局灶節(jié)段性腎小球腎病等已被證實(shí)與足細(xì)胞的損傷存在聯(lián)系。而足細(xì)胞是有絲分裂期后的細(xì)胞,高度分化,分裂增殖能力有限,故損傷丟失后難以再生。足細(xì)胞損傷后,周邊的足細(xì)胞會(huì)肥大以覆蓋住裸露的毛細(xì)血管叢,同時(shí),肥大的足細(xì)胞的易損性會(huì)增加。當(dāng)肥大的足細(xì)胞失代償后,不足以覆蓋住裸露的毛細(xì)血管叢時(shí),失去足細(xì)胞支撐的基底膜就會(huì)凸向腎小囊,進(jìn)而與腎小球壁層細(xì)胞粘連,最終導(dǎo)致會(huì)腎小球硬化的發(fā)生。足細(xì)胞損傷后會(huì)發(fā)生形態(tài)學(xué)及非形態(tài)學(xué)的改變,形態(tài)學(xué)的改變?nèi)缱阃蝗诤?細(xì)胞肥大及凋亡等；而非形態(tài)學(xué)的改變?nèi)缱慵?xì)胞特異蛋白分子(synaptopodin等)及足細(xì)胞骨架的改變等。例如LPS就是通過(guò)影響肌動(dòng)纖維的重組從而引起足突動(dòng)力系統(tǒng)改變,在體外實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為遷移能力及侵襲能力的增強(qiáng),即活動(dòng)力增強(qiáng),而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中就表現(xiàn)為足細(xì)胞足突的融合,進(jìn)而導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。在人類腎小球疾病及LPS誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中可以觀察到足細(xì)胞尿激酶受體(urokinase receptor,uPAR)表達(dá)增加。uPAR是糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白中的一種,主要在炎癥細(xì)胞中表達(dá),它通過(guò)與細(xì)胞表面的整合素結(jié)合,形成信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合體,在炎癥細(xì)胞的遷徙中起重要作用。在足細(xì)胞損傷的過(guò)程中,為了適應(yīng)環(huán)境,足細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一些異常蛋白以避免損傷的惡化,及存在細(xì)胞骨架蛋白的丟失,這種丟失以肌動(dòng)蛋白為主。同時(shí),也存在一些足細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白的缺失,例如WT1及Synaptopodin等。在足細(xì)胞胞漿區(qū)α3β1整合素通過(guò)肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合物(包括talin,vinculin等)與骨架蛋白肌動(dòng)蛋白相互作用,從而維持濾過(guò)膜結(jié)構(gòu)正常,且其對(duì)于GBM的黏附極其重要。α3β1整合素通過(guò)下調(diào)Bax/Bcl2/PKC通路阻止足細(xì)胞凋亡脫落。整合素是粘附分子的一種,它們存在于細(xì)胞表面,化學(xué)成分是糖蛋白,可以指導(dǎo)細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì),維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能,介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附及信息傳遞。而在腎臟組織中,以p1類整合素最為多見(jiàn)[1]。整合素的p鏈負(fù)責(zé)與下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互作用[2]。α3β1作為足細(xì)胞最主要表達(dá)的整合素,主要沿著GBM分布,同時(shí),將足細(xì)胞錨定于GBM上,從而維持腎小球的正常濾過(guò)功能。以往存在實(shí)驗(yàn)證實(shí),利用特異抗體阻斷β1結(jié)合域,可以引起足突消失及蛋白尿的發(fā)生。而進(jìn)一步的研究表明,α3β1整合素通過(guò)下調(diào)Bax/Bcl-2、蛋白激酶C(PKC)通路阻止足細(xì)胞凋亡和脫落[3]。以上結(jié)果均提示β1整合素在足細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及損傷中存在重要的作用。相對(duì)于β1整合素而言,β3整合素在腎臟表達(dá)的較少。但是近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn), uPAR-β3整合素系統(tǒng)在蛋白尿的發(fā)生和局灶性節(jié)段性腎小球硬化疾病的發(fā)生中存在重要的作用。uPAR是一種與細(xì)胞活動(dòng)性相關(guān)的分子,主要表達(dá)在活動(dòng)性強(qiáng)的細(xì)胞上。p3整合素與uPAR結(jié)合為脂質(zhì)依賴的復(fù)合物,共同地表達(dá)于足細(xì)胞上。因而,β3整合素結(jié)構(gòu)的改變會(huì)該復(fù)合物的活化,進(jìn)而導(dǎo)致與配體之間的吸引力增加。在小鼠體內(nèi),活化的β3整合素會(huì)導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。相反,阻斷uPAR的表達(dá)及β3整合素的活化會(huì)減少足細(xì)胞足突的融合及蛋白尿的發(fā)生[4]。已有研究表明,NFAT-鈣調(diào)磷酸酶途徑參與活化足細(xì)胞中uPAR的轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致β3整合素的活化和蛋白尿的發(fā)生。運(yùn)用環(huán)孢素或NFAT抑制劑11R-VIVIT可阻斷該途徑且減少u(mài)PAR的表達(dá)。并且,鈣調(diào)磷酸酶-]NFAT途徑存在于uPAR的上游[5-6]。NF-κB配體的受體活化因子(RANKL)及RANK共同組成了TNF受體超家族成員信號(hào)傳導(dǎo)路徑。RANKL是破骨細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟過(guò)程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子[7]。在破骨細(xì)胞中,RANKL通過(guò)與RANK結(jié)合,再募集TNF受體相關(guān)因子,激活核轉(zhuǎn)錄因子κB (NF-κB)或分裂原激活的蛋白激酶(MAPKs),從而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生存、分化、凋亡與活化。而骨保護(hù)素(OPG)是這一旁路的誘騙(decoy)受體,它通過(guò)與RANK結(jié)合從而阻斷這一信號(hào)途徑。對(duì)該系統(tǒng)的研究,以往的研究主要集中在骨質(zhì)疏松及骨腫瘤性疾病中。但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),該系統(tǒng)不僅在腎性骨病,前列腺癌及乳腺癌等疾病的發(fā)病中起重要作用[8-9],且參與自身免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn),該系統(tǒng)也與足細(xì)胞的損傷存在一定聯(lián)系。在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn),正常足細(xì)胞上RANK表達(dá)低水平,但在足細(xì)胞疾病中,RANK表達(dá)水平明顯升高；在動(dòng)物模型中,嘌呤霉素氨基核苷可誘導(dǎo)大鼠足細(xì)胞產(chǎn)生RANK,且誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡,在5/6腎切除動(dòng)物模型中,RANK也是高表達(dá)的,且纈沙坦可減少其水平；以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均說(shuō)明RANK可能是導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的有害因子[14-15]。因此,為進(jìn)一步探討足細(xì)胞損傷的原因,本實(shí)驗(yàn)利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)得到足細(xì)胞特異性RANK敲除鼠,觀察在足細(xì)胞中特異敲除RANK基因?qū)ψ慵?xì)胞所造成的影響,進(jìn)而制作LPS誘導(dǎo)的小鼠短暫性蛋白尿模型,通過(guò)觀察KO組小鼠與其同窩對(duì)照組小鼠(W組)及普通C57小鼠(C57組),探討RANK參與足細(xì)胞損傷具體機(jī)制及可能的相關(guān)分子, 為治療腎小球疾病尋找關(guān)鍵的調(diào)控靶點(diǎn)。研究目的RANK在足細(xì)胞損傷中的意義。損傷足細(xì)胞中RANK的信號(hào)途徑。研究方法一、足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠鑒定及表型觀察。(一)、RABK：小鼠的培育及鑒定B6.Cg-Tg(NPHS2-cre)295Lbh/J小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室,RANK-loxP鼠由澳大利亞University of Western Australia的鄭銘豪教授提供,在南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院飼養(yǎng)及繁殖。飼養(yǎng)與中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的無(wú)特定病原菌(SPF)環(huán)境中,12小時(shí)光照／黑暗交替,自由進(jìn)食、飲水。留小鼠尾巴提取DNA后進(jìn)行基因型鑒定。普通C57小鼠購(gòu)于中山大學(xué)東校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的無(wú)特定病原菌(SPF)環(huán)境中,12小時(shí)光照／黑暗交替,自由進(jìn)食、飲水。選擇不同基因型的雌性小鼠各6只,年齡為6-8周,體重為20-30g,進(jìn)行表型觀察,內(nèi)容包括：體重和腎臟形態(tài)。二、建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型,觀察三組小鼠腎臟組織病理,足突融合及對(duì)Integrin-β1、integrin-β3、uPAR表達(dá)的影響。(一)、動(dòng)物分組及脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型的建立隨機(jī)選取年齡為6-8周的雌性小鼠經(jīng)基因鑒定為RANK足細(xì)胞特異敲除鼠(RANK-/-),野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠各6只,體重為20-30g。分為C57組(普通C57小鼠),W組(野生型對(duì)照組小鼠)及KO組(足細(xì)胞特異性RANK-/-小鼠)。在LPS前分別收集18只小鼠的24h尿液,檢測(cè)尿量及白蛋白肌酐比。之后給予100μg/只腹腔注射LPS,于24h后收集24h尿液測(cè)量尿量及白蛋白肌酐比。所有小鼠飼養(yǎng)于代謝籠中,自由進(jìn)食和飲水。(二)、標(biāo)本取材及處理分別在給藥前及給藥后第二天收集24h尿液,分別處死三組動(dòng)物。留取腎皮質(zhì),一部分于液氮罐中長(zhǎng)期保存,另一部分用于病理檢查并制作冰凍切片用于后期免疫熒光實(shí)驗(yàn),電鏡檢查以及提取蛋白做westernblot實(shí)驗(yàn)。(三)、各指標(biāo)的檢測(cè)與觀察1、LPS造模后尿白蛋白肌酐比測(cè)定：小鼠腹腔注射LPS后收集24h尿液。按照試劑盒要求,用ELISA法測(cè)定尿液中白蛋白及肌酐的含量,計(jì)算尿白蛋白肌酐比值。2、病理：LPS前后三組小鼠均取腎組織制成石蠟切片行PAS染色,觀察LPS前后三組腎小球和腎小管損傷程度。WT 1可作為足細(xì)胞胞核的特異性標(biāo)記用來(lái)計(jì)數(shù)足細(xì)胞。免疫組化：兔抗大鼠WT1(SC-192)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,SP法按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用病理圖像分析軟件做半定量分析,每個(gè)切片隨機(jī)選取10個(gè)腎小球(400倍),對(duì)于WT1染色的切片,在電腦保存400倍圖像的同時(shí),計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性的足細(xì)胞個(gè)數(shù)。3、電鏡：小鼠腹腔注射LPS后收集完24h尿液,第二天處死。取新鮮腎臟皮質(zhì)標(biāo)本1-2mm3,立即送冰凍切片。美國(guó)FEI透射電鏡(Tecnai G2 Spirit Twin):觀察腎小球基底膜厚度,足細(xì)胞形態(tài)。每只小鼠選擇1-2個(gè)腎小球,對(duì)每個(gè)腎小球隨機(jī)選取10-20個(gè)不同位置進(jìn)行測(cè)定。4、免疫熒光及激光共聚焦：1).臨用前拿出切片,室溫充分晾干,切忌干片；2).用1xPBS洗3次×5分鐘／每次；3).吸取0.5%TritonX-100置于組織上,透化20分鐘;4).用1 xPBS洗3次×5分鐘／每次；5).滴加5%BSA置于室溫下封閉10分鐘；6).加一抗在濕盒里,4℃過(guò)夜；7).1×PBS洗3次,每次5分鐘；8).再于組織上滴加第二種一抗(須與第一種一抗種屬不同)；9).滴加熒光二抗(用I%BSA稀釋)置于室溫37℃,反應(yīng)60分鐘,注意避光；10),.用1xPBS洗3次×5分鐘／每次；11).如需做雙重免疫熒光,再滴加第二種二抗于37℃,反應(yīng)60分鐘；12).用1xPBS洗3次×5分鐘/每次；13).抗熒光衰減劑封片；14).濕盒避光放入4℃冰箱待觀察；15).共聚焦顯微鏡觀察。5、Westernblot:小鼠腹腔注射LPS后收集完24h尿液,第二天處死。取新鮮腎臟切取黃豆粒大小用錫箔紙包住放入液氮中,迅速取出后用研缽研磨至糊狀,放入細(xì)胞裂解液中,再用細(xì)胞超聲粉碎機(jī)粉碎；冰上靜置10min。 14000rpm,5min離心,取上清至新EP管,而后8000rpm, 10min離心,取上清為相應(yīng)標(biāo)本的蛋白。用BSA試劑盒測(cè)量每個(gè)標(biāo)本的蛋白濃度,計(jì)算配平后將蛋白變性。蛋白電泳使用7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠,轉(zhuǎn)膜使用PVDF膜,轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂牛奶室溫封閉1h,而后將膜放入特異性抗體中4℃過(guò)夜。第二天用PBS-0.1%Tween20洗膜,之后與相應(yīng)的二抗結(jié)合室溫孵育1h; PBS-0.1%Tween20洗膜3次,每次10min,暗房曝光。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果以x±s表示。本實(shí)驗(yàn)所有的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,組間比較采用單因素方差分析,Levene檢驗(yàn)方差齊性為方差齊,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠的體質(zhì)量,腎臟形態(tài)、重量與野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將RANK-loxP鼠與NPHS2啟動(dòng)Cre的轉(zhuǎn)基因鼠B6.Cg-Tg(NPHS2-cre)295Lbh/J交配,篩選出同時(shí)含有Cre及RANK兩種基因型的子代小鼠,其足細(xì)胞將缺失RANK基因表達(dá)。在小鼠成年期(6-8周時(shí)),對(duì)6只雌性的RANK-/-小鼠與WT小鼠及普通C57小鼠進(jìn)行比較。C57組小鼠體重(25.47±6.03)vs W組小鼠體重(22.45±2.38) vs KO組小鼠體重(23.72±.41)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C57組小鼠腎臟重量(1.27±0.05)vs W組小鼠腎臟重量(1.12±0.11) vs KO組小鼠腎臟重量(1.15±0.10)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二、注射脂多糖(LPS)后,足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠(KO組)蛋白尿較野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠有所減少。實(shí)驗(yàn)前,三組小鼠尿白蛋白肌酐比分別為C57組(6.34±0.68)vs W組(7.39±1.84) vs KO組(7.40±1.60),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。注射LPS后24h,三組小鼠尿白蛋白肌酐比(μg/mg)開(kāi)始顯著升高,提示造模成功。同時(shí)KO組(23.70±9.90)明顯低于野生型對(duì)照組(107.56±22.32)及普通C57小鼠組(132.13±14.26),(P0.05)。三、注射脂多糖(LPS)后,三組小鼠腎臟組織病理結(jié)果無(wú)明顯改變,三組小鼠足細(xì)胞數(shù)目均有所下降,但KO組足細(xì)胞數(shù)目較其余兩對(duì)照組下降得更少。(一)、三組小鼠腎臟組織病理結(jié)果實(shí)驗(yàn)前,各組小鼠腎臟組織在PAS染色下觀察形態(tài)正常,腎小球和腎小管均無(wú)病變。注射LPS后,三組小鼠的腎小球和腎小管病理改變無(wú)明顯差別。(二)、足細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果LPS前,三組小鼠足細(xì)胞數(shù)目差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS后,三組小鼠足細(xì)胞數(shù)目都有所下降,但C57組及W組的足細(xì)胞數(shù)目明顯比KO組低,且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示LPS后C57組及W組足細(xì)胞丟失得更多；LPS后KO組足細(xì)胞也存在丟失,但較對(duì)照組少。四、電鏡下足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠的足細(xì)胞足突融合較野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠有所減少。實(shí)驗(yàn)前,各組小鼠腎臟組織在電鏡下觀察形態(tài)正常,足細(xì)胞無(wú)病變。注射LPS后24h,可以觀察到三組小鼠足細(xì)胞足突出現(xiàn)融合。但在C57組及W組,足細(xì)胞足突融合范圍更廣泛,而KO組足細(xì)胞足突融合情況明顯較對(duì)照組減輕。五、脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中,三組小鼠腎臟組織中Integrin-β1、integrin-β3、uPAR表達(dá)的影響。(一)、使用激光共聚焦顯微鏡觀察雙重免疫熒光染色的小鼠腎臟組織Synaptopodin(綠色熒光)是足細(xì)胞特異性骨架蛋白,可以用來(lái)定位足細(xì)胞。在注射LPS前,三組小鼠Synaptopodin表達(dá)無(wú)差異。已知在正常小鼠腎小球上,RANK (紅色熒光)是微量表達(dá)于足細(xì)胞的。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,注射LPS前,C57組及W組RANK均微量表達(dá),但KO組無(wú)RANK表達(dá)。在注射LPS后,三組小鼠Synaptopodin表達(dá)均有所下降,且C57組及W組RANK表達(dá)量明顯上升,但KO組依舊無(wú)RANK表達(dá)。提示KO組的確為足細(xì)胞特異性RANK敲除鼠。脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中,三組小鼠腎臟組織中integrin-β1表達(dá)的影響。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,注射LPS前三組小鼠integrin-β1(紅色熒光)在腎小球上表達(dá)無(wú)明顯差異,與Synaptopodin(綠色熒光)共定位。而注射LPS后,三組小鼠integrin-β1的表達(dá)均有所下降,但KO組小鼠相對(duì)其他兩組小鼠integrin-β1表達(dá)的下降有所增加。2、脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中,三組小鼠腎臟組織中integrin-β3表達(dá)的影響。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,注射LPS前三組小鼠integrin-β3(紅色熒光)在腎小球上表達(dá)無(wú)明顯差異,與Synaptopodin(綠色熒光)共定位。而注射LPS后,三組小鼠integrin-β3的表達(dá)均有所升高,但KO組小鼠相對(duì)其他兩組小鼠integrin-β3表達(dá)的升高有所減少。(二)、使用Westernblot檢測(cè)三組小鼠腎臟組織中integrin-β1、integrin-β3、 uPAR表達(dá)的影響。1、脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中,三組小鼠腎臟組織中integrin-β1表達(dá)的影響。Western方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS后三組小鼠腎臟組織的Integrin-β1表達(dá)均有所下降,但KO組相對(duì)于C57組及W組,Integrin-β1的表達(dá)下降的更多。脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中,三組小鼠腎臟組織中integrin-β3表達(dá)的影響。Western方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS后三組小鼠腎臟組織的Integrin-β3表達(dá)均有所上升,但KO組相對(duì)于C57組及W組,Integrin-β3的表達(dá)上升的更少。3、脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中,三組小鼠腎臟組織中uPAR表達(dá)的影響。Western方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS后三組小鼠腎臟組織的、uPAR表達(dá)均有所上升,但KO組相對(duì)于C57組及W組,uPAR的表達(dá)上升的更少。結(jié)論一、足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠的體質(zhì)量,腎臟形態(tài)、重量及蛋白尿水平與野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二、在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中,足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠的蛋白尿水平較其余兩對(duì)照組有明顯減少,提示RANK在足細(xì)胞損傷中具有重要價(jià)值。三、在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中,三組小鼠腎臟組織病理結(jié)果無(wú)明顯改變,三組小鼠足細(xì)胞數(shù)目均有所下降,但KO組足細(xì)胞數(shù)目較其余兩對(duì)照組下降得更少,且電鏡下KO組足突融合較其余兩對(duì)照組有所減少,提示足細(xì)胞特異性敲除RANK基因?qū)ψ慵?xì)胞具有保護(hù)意義。四、在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中,KO組小鼠的integrin-β1表達(dá)較其余兩對(duì)照組小鼠下降的更多,integrin-β3表達(dá)較其余兩對(duì)照組小鼠上升的更少,uPAR的表達(dá)較其余兩對(duì)照組小鼠上升的更少,提示在足細(xì)胞中RANK基因可能通過(guò)與integrin-β1,uPAR及integrin-β3等分子相互作用,從而介導(dǎo)足細(xì)胞的損傷,影響蛋白尿的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：RANK LPS 足細(xì)胞 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692
【目錄】：

• 摘要3-13
• ABSTRACT13-22
• 引言22-26
• 材料與方法26-45
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料26
• 2. 主要試劑26
• 3. 主要儀器26-27
• 4. 足細(xì)胞特異RANK基因敲除鼠的培育及鑒定27-30
• 5. 脂多糖誘導(dǎo)的短暫蛋白尿小鼠動(dòng)物模型的建立30-31
• 6. 尿蛋白的測(cè)定31-34
• 7. 腎臟病理分析及足細(xì)胞計(jì)數(shù)34-37
• 8. 電鏡下足細(xì)胞足突融合的觀察37-38
• 9. 免疫熒光及激光共聚焦38-40
• 10. 蛋白免疫印跡40-44
• 11. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理44-45
• 結(jié)果45-55
• 一、足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠的體質(zhì)量,腎臟形態(tài)、重量與野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義45-47
• 二、注射脂多糖(LPS)后,足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠(KO組)蛋白尿較野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠有所減少47-48
• 三、注射脂多糖(LPS)后,三組小鼠腎臟組織病理結(jié)果無(wú)明顯改變,三組小鼠足細(xì)胞數(shù)目均有所下降,但KO組足細(xì)胞數(shù)目較其余兩對(duì)照組下降得更少48-50
• 四、電鏡下足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠的足細(xì)胞足突融合較野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠有所減少50-51
• 五、脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中,三組小鼠腎臟組織中RANK、Integrin-β1、integrin-β3表達(dá)的影響51-55
• 討論55-61
• 結(jié)論61-63
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 中英文詞表66-67
• 在讀碩士期間的成果67-68
• 致謝68-69

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