本文關(guān)鍵詞：miR-17-92基因簇miRNA在染料木黃酮暴露致精子生產(chǎn)障礙中的作用及機(jī)制

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【摘要】：染料木黃酮(genistein, GEN)是一種典型的植物雌激素,其具有擬雌激素效應(yīng),因此可對(duì)男性生殖功能產(chǎn)生影響。然而,具體的潛在機(jī)制仍然不明。miRNA是一類非編碼RNA,可以通過結(jié)合靶基因3'-UTR區(qū),并沉默靶基因來發(fā)揮生物學(xué)功能。已有研究指出miRNA在精子生成中發(fā)揮重要作用。此外有報(bào)道指出,miR-17-92在精子生成中發(fā)揮重要作用,并且雌激素可以導(dǎo)致miR-17-92表達(dá)發(fā)生改變。為了探討miR-17-92是否在GEN暴露引起的精子生成障礙中發(fā)揮作用,我們通過檢測不育男性受試者尿液GEN暴露水平以及精漿中miR-17-92簇miRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)miR-19b-1、miR-20a和miR-92a-1在GEN較高暴露組顯著高表達(dá),并且該組受試者精子活力顯著下降,這就提示我們miR-17-92可能在GEN暴露引起的精子生成障礙中發(fā)揮作用。隨后我們利用成年ICR小鼠,使用不同劑量GEN(包括0,0.5,5,50以及250 mg/kg/day)灌胃染毒35天,發(fā)現(xiàn)小鼠附睪精子的平均速率(VAP)、直線速率(VSL)和曲線速率(VCL)在5 mg/kg/day劑量組顯著減少,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),該劑量組小鼠睪丸組織中miR-17和miR-20a的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。通過對(duì)比人和小鼠中的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)miR-20a在人和小鼠中均呈現(xiàn)顯著高表達(dá)。通過生物信息學(xué)方法分析,發(fā)現(xiàn)Limk1是miR-20a的靶基因,并且該基因在精子生成中發(fā)揮重要作用,基因和蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果也表明,Limk1表達(dá)水平在GEN染毒組顯著下降,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也表明Limk1是miR-20a的靶基因。因此這些結(jié)果表明,Limk1作為miR-20a的靶基因,可能在miR-20a參與的GEN暴露致精子生成障礙中發(fā)揮作用。第一部分：miR-17-92基因簇miRNA表達(dá)水平與GEN暴露的關(guān)聯(lián)研究目的在人群水平研究miR-17-92基因簇miRNA和GEN暴露致精子生成障礙的關(guān)聯(lián)。方法1.使用UPLC-MS/MS的方法,檢測了130名不育男性尿液GEN暴露水平；2.通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù),檢測受試者精漿中的miR-17-92表達(dá)水平；3.根據(jù)受試者GEN內(nèi)暴露水平,將受試者分成四組,分析精漿miR-17-92表達(dá)水平與GEN暴露之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果1.通過比較不同GEN暴露組受試者的精液參數(shù),我們發(fā)現(xiàn)在所納入的不育受試者中,GEN較高暴露組(即組3,GEN暴露量為76.32-281.96 ng/ml)的受試者精子活力與GEN低暴露組相比顯著下降(P0.01)；2.受試者精漿中miR-19b-1、miR-20a和miR-92a-1在組3中顯著高表達(dá)(P0.05),其余幾條miRNA則未觀察到顯著性差異。結(jié)論在男性不育患者中,較高暴露的GEN與精子生成障礙有關(guān),并且主要集中在精子活力,而miR-17-92可能在GEN暴露導(dǎo)致的精子生成障礙中發(fā)揮作用。第二部分：miR-17-92基因簇miRNA在GEN染毒小鼠生精障礙中的作用及機(jī)制目的在GEN染毒小鼠模型中研究miR-17-92基因簇中關(guān)鍵miRNA在GEN染毒引起的小鼠精子生成障礙中的作用以及機(jī)制。方法1.通過使用不同劑量的GEN(0,0.5,5,50和250 mg/kg/day)對(duì)7周齡雄性ICR小鼠灌胃染毒35天,以研究不同劑量GEN對(duì)小鼠精子生成的影響；2.通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù),檢測小鼠睪丸組織中miR-17-92表達(dá)水平；3.結(jié)合人群結(jié)果,篩選出人鼠中共同差異的miR-17-92基因簇miRNA,隨后通過靶基因預(yù)測軟件,篩選出共同靶基因,采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-17-92基因簇關(guān)鍵miRNA與靶基因結(jié)合特異性；4.使用qRT-PCR和Western blotting技術(shù),檢測靶基因表達(dá)水平。結(jié)果1.雄性ICR小鼠經(jīng)5 mg/kg/day的GEN灌胃處理后,小鼠附睪精子運(yùn)動(dòng)參數(shù),包括平均速率(VAP)、直線速率(VSL)和曲線速率(VCL)三個(gè)指標(biāo),均呈顯著降低；2.小鼠睪丸組織miR-17及miR-20a在5 mg/kg/day組顯著高表達(dá),結(jié)合人群結(jié)果,發(fā)現(xiàn)miR-20a在人鼠中均呈現(xiàn)顯著差異表達(dá),因此選定miR-20a作為關(guān)鍵靶標(biāo)niRNA;3.通過靶基因預(yù)測軟件以及人鼠通路富集結(jié)果比對(duì),發(fā)現(xiàn)肌鈣蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路是人鼠中均存在的miR-20a靶基因富集通路,并且該通路與基于細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)的精子發(fā)生密切相關(guān),其中Limkl在該通路中發(fā)揮重要調(diào)控作用；4.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明,Limkl是miR-20a的靶基因；5. Limkl在5 mg/kg/day的GEN灌胃組小鼠睪丸組織中顯著低表達(dá),并且蛋白表達(dá)結(jié)果與基因表達(dá)結(jié)果一致。結(jié)論1.GEN在5 mg/kg/day灌胃劑量下可以導(dǎo)致雄性成年ICR小鼠精子生成障礙；2. Limkl作為miR-20a的靶基因,可能在GEN暴露導(dǎo)致的精子生成障礙中發(fā)揮作用。
【關(guān)鍵詞】：染料木黃酮 精漿 miR-17-92 男性不育 精子生成障礙 染料木黃酮 miR-20a Limk1 精子生成障礙
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R698.2
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 第一部分 miR-17-92基因簇miRNA表達(dá)水平與GEN暴露的關(guān)聯(lián)研究16-31
• 前言16-18
• 材料與方法18-24
• 結(jié)果24-29
• 分析與討論29-31
• 第二部分 miR-17-92基因簇miRNA在GEN染毒小鼠生精障礙中的作用及機(jī)制31-53
• 前言31-33
• 材料與方法33-41
• 結(jié)果41-51
• 分析與討論51-53
• 小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 文獻(xiàn)綜述58-86
• 參考文獻(xiàn)73-86
• 附錄86-93
• 附錄一 主要縮略詞英中文對(duì)照86-88
• 附錄二 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)88-89
• 附錄三 在校期間發(fā)表的論文及獲獎(jiǎng)情況89-90
• 附錄四 人群研究相關(guān)證明和基礎(chǔ)材料90-93
• 致謝93-94

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