本文關(guān)鍵詞：腎透明細(xì)胞癌啟動子區(qū)域DNA甲基化研究

  更多相關(guān)文章： 腎透明細(xì)胞癌 DNA甲基化 啟動子 診斷標(biāo)記物

【摘要】：目的腎癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤中致死率最高的惡性腫瘤,腎透明細(xì)胞癌為最常見的腎癌子類型,約占腎癌的80%-90%左右,大多數(shù)患者就診時已是中晚期惡性腫瘤。DNA甲基化作為主要的表觀遺傳調(diào)控機制,因其發(fā)生于癌前病變而受到了研究者的廣泛關(guān)注。本研究通過分析腎透明細(xì)胞癌啟動子區(qū)域的差異甲基化,挖掘最適的診斷標(biāo)記物,驗證標(biāo)記物的甲基化水平及關(guān)鍵基因的mRNA表達,探討甲基化對腎透明細(xì)胞癌臨床診斷的應(yīng)用價值及腎透明細(xì)胞癌啟動子的甲基化模式與其癌發(fā)的關(guān)系。方法1.生物信息學(xué)分析：(1)使用TCGA數(shù)據(jù)庫下載腎透明細(xì)胞癌臨床數(shù)據(jù)、HumanMethylation450 level 1原始數(shù)據(jù)及RNA-seq V2 level 3數(shù)據(jù)；(2)排除患有其他癌癥或曾接受過輔助治療或種族不清楚的病人樣本；(3)使用R語言RnBeads軟件包對納入的癌癥與癌旁組織樣本進行甲基化差異分析,分析啟動子區(qū)域甲基化特征；(4)采用縮小重心分類算法挖掘啟動子區(qū)域上區(qū)分癌癥和癌旁的最佳的甲基化位點；(5)使用Deseq軟件包對癌癥與癌旁正常樣本進行基因表達差異分析；(6)對啟動子差異甲基化位點所在基因進行GO分析及KEGG pathways分析；2.實驗及GEO數(shù)據(jù)集驗證：(1)焦磷酸測序檢測19對腎透明細(xì)胞癌與其對應(yīng)的癌旁組織及分析GEO數(shù)據(jù)集,對診斷標(biāo)記位點驗證；(2)實時熒光定量檢測19對腎透明細(xì)胞癌與其對應(yīng)的癌旁組織及分析GEO數(shù)據(jù)集,對三個啟動子發(fā)生異常甲基化且差異表達的基因進行mRNA表達驗證；Sequenom質(zhì)譜檢測基因啟動子甲基化程度；(3)Spearman等級相關(guān)分析分別計算所驗證的三個基因啟動子甲基化對其mRNA表達的影響；(4) Log-rank test與COX比例風(fēng)險回歸模型分析所驗證的基因在腎透明細(xì)胞癌中啟動子甲基化與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果1.TCGA甲基化及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示：對比癌旁組織,腎透明細(xì)胞癌啟動子區(qū)域共有526個位點低甲基化、460個位點高甲基化(FDR 1E-10,|Delta Beta|0.2),138個基因低甲基化、35個基因高甲基化(FDR 0.05,|Delta Beta| 0.2),1798個基因mRNA低表達、2641個基因mRNA高表達(FDR 0.05,|log2 FC|1);2.啟動子區(qū)域上,cg11201447、 cg25247520、cg13309012、cg08995609為區(qū)分腎透明細(xì)胞癌和癌旁組織的最佳甲基化位點且在腎透明細(xì)胞癌中均表現(xiàn)為低甲基化,它們對TCGA樣本診斷的誤判率為1.8%,其聯(lián)合診斷AUC值達0.997；焦磷酸測序檢測cg08995609位點在腎透明細(xì)胞癌組織中呈顯著的低甲基化(P=0.700E-3),GSE61441數(shù)據(jù)集顯示這四個位點均呈顯著的低甲基化且AUC值達0.996；3.低甲基化位點所在基因主要參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等生物過程及I型糖尿病、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、移植物抗宿主疾病3條生物通路,高甲基化位點所在基因主要參與細(xì)胞黏附、信號傳導(dǎo)等生物過程及神經(jīng)配體-受體相互作用生物通路；4. TCGA數(shù)據(jù)分析顯示：腎透明細(xì)胞癌組織中,CYP4B1和RAB25基因低表達而啟動子高甲基化,CA9基因高表達而啟動子低甲基化,這三個基因的啟動子甲基化水平與其mRNA表達水平具有顯著的相關(guān)性；實時熒光定量實驗及10套GEO數(shù)據(jù)集顯示RAB25基因低表達、CA9基因高表達,而CYP4B1基因的差異表達不明顯；Sequenom質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示：RAB25啟動子在腎透明細(xì)胞癌組織中呈高甲基化(P=0.0003);5. Log-rank test顯示：CA9啟動子甲基化水平低的腎透明細(xì)胞癌患者較甲基化水平高的生存率高,COX比例風(fēng)險回歸分析顯示：CA9啟動子甲基化進行該疾病的獨立預(yù)后檢驗無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.238)。結(jié)論1.在組織水平上,cg11201447、cg25247520、cg13309012、 cg08995609四個甲基化位點的聯(lián)合診斷是腎透明細(xì)胞癌的潛在標(biāo)記物；2.腎透明細(xì)胞癌中,RAB25啟動子高甲基化抑制其mRNA的表達水平；3.CA9啟動子甲基化不是腎透明細(xì)胞癌的獨立預(yù)后因子；4.腎透明細(xì)胞癌中,DNA甲基化可能通過調(diào)控免疫反應(yīng)、細(xì)胞黏附等生物過程中關(guān)鍵基因的表達,從而促進該腫瘤的癌發(fā)。
【關(guān)鍵詞】：腎透明細(xì)胞癌 DNA甲基化 啟動子 診斷標(biāo)記物
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 英文縮略詞6-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 第一章 基于全基因組DNA甲基化芯片技術(shù)建立腎透明細(xì)胞癌啟動子區(qū)域的DNA甲基化譜15-44
• 1. 前言15-18
• 2. 研究對象與研究方法18-23
• 2.1 研究對象18
• 2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫腎透明細(xì)胞癌甲基化及mRNA數(shù)據(jù)下載18-19
• 2.3 全基因組甲基化差異分析19-20
• 2.4 縮小重心分類算法挖掘診斷標(biāo)記甲基化位點20-21
• 2.5 負(fù)二項分布模型進行基因表達差異分析21-22
• 2.6 通路富集分析22-23
• 3. 結(jié)果23-35
• 3.1 樣本信息23-24
• 3.2 腎透明細(xì)胞癌與癌旁組織的啟動子差異DNA甲基化位點24-26
• 3.3 腎透明細(xì)胞癌與癌旁組織的啟動子差異DNA甲基化基因26-27
• 3.4 診斷標(biāo)記甲基化位點27-31
• 3.5 腎透明細(xì)胞癌與癌旁組織的mRNA表達差異基因31-33
• 3.6 通路富集33-35
• 4. 討論35-39
• 參考文獻A39-44
• 第二章 診斷標(biāo)記位點甲基化程度及RAB25、CA9、CYP4B1基因表達水平的驗證44-86
• 1. 前言44-45
• 2. 材料及方法45-63
• 2.1 組織樣本45-46
• 2.2 主要試劑、耗材及設(shè)備46-47
• 2.3 實驗步驟47-62
• 2.4 GEO數(shù)據(jù)驗證62-63
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析63
• 3. 結(jié)果63-74
• 3.1 實驗樣本信息63-64
• 3.2 診斷標(biāo)記位點的甲基化程度驗證64-67
• 3.3 RAB25、CA9、CYP4B1基因mRNA表達水平驗證67-70
• 3.4 RAB25、CA9、CYP4B1基因啟動子甲基化對其mRNA表達影響70-71
• 3.5 腎透明細(xì)胞癌組織中RAB25、CA9啟動子甲基化與患者預(yù)后的關(guān)系71-74
• 4. 討論74-79
• 5. 全文小結(jié)79-81
• 5.1 本研究的結(jié)論79
• 5.2 本研究的創(chuàng)新性和局限性79-81
• 參考文獻B81-86
• 第三章 腎癌表觀遺傳機制的研究進展86-91
• 1. DNA甲基化87
• 2. 組蛋白修飾87-89
• 參考文獻C89-91
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及成果91-92
• 致謝92

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本文編號：581390