本文關(guān)鍵詞：氯胺酮及衍生物Methoxetamine引起膀胱功能障礙的機(jī)制研究

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【摘要】：背景氯胺酮(Ketamine, KET)作為一種N-甲基-D天門冬氨酸(N-methyl-D-asparticacid, NDMA)受體拮抗劑,活躍在臨床麻醉和鎮(zhèn)痛領(lǐng)域已有半個世紀(jì),但由于能引起強(qiáng)烈的欣快感、幻覺、瀕死感,使其很快成為娛樂場所流行的濫用藥物”K粉”。早期對氯胺酮濫用的研究像其他毒品一樣主要集中在精神、神經(jīng)系統(tǒng)改變。自Shahani在2007年發(fā)現(xiàn)9名濫用氯胺酮而引起嚴(yán)重的下尿路癥狀(lower urinary tract symptoms, LUTS)的青年,在歐洲、亞洲陸續(xù)報道了大量病例,氯胺酮相關(guān)性泌尿系統(tǒng)損害(Ketamine Associated Urinary Dysfunction, KAUD)逐漸引起人們的重視�；颊咧饕韵履蚵钒Y狀為主,逐漸進(jìn)展可導(dǎo)致膀胱攣縮和上尿路損害,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。但由于其臨床特點、發(fā)病機(jī)制尚不明確,尚無統(tǒng)一規(guī)范的治療指導(dǎo)。距離該病被廣泛發(fā)現(xiàn)已有8年時間,病情不斷進(jìn)展的患者逐漸增多,保守治療針對此類難治性的患者效果不佳。臨床分期可以從一定程度上判斷疾病的進(jìn)展,同時也是為疾病的評估和治療方案的選擇提供指導(dǎo),對避免延誤和過度醫(yī)療有很重要的作用。KAUD有其特殊的復(fù)雜性,除了膀胱的受累之外,上尿路也會隨病程進(jìn)展發(fā)生不同程度的病變�，F(xiàn)有的報道中各種治療的效果不一,疾病的進(jìn)展很可能是影響因素之一,僅根據(jù)經(jīng)驗判斷治療的策略和時機(jī)并不絕對可靠,尤其關(guān)于外科手術(shù)干預(yù)時機(jī)引起了專家們的思考。目前,尚未有研究嘗試對氯胺酮相關(guān)性泌尿系統(tǒng)損害的疾病進(jìn)展進(jìn)行分期評估,因此本研究第二部分通過回顧氯胺酮相關(guān)性泌尿系統(tǒng)損害患者的病史、實驗室和影像學(xué)資料,提出相應(yīng)的評分分期系統(tǒng),是首次根據(jù)疾病的進(jìn)展進(jìn)行臨床分期,并為階梯式治療策略提供依據(jù)。Methoxetamine (MXE)是氯胺酮的結(jié)構(gòu)衍生物,同樣是NDMA受體拮抗劑。另外,MXE可以結(jié)合血清素轉(zhuǎn)運體(serotonin transporter, SERT),降低5羥色胺的再攝取,從而引起腦中5羥色胺水平增高,且證實可增加多巴胺釋放和阻止多巴胺的再攝取。MXE最初是為了減少KET的泌尿系統(tǒng)毒性和其抗抑郁作用而合成的。作為新型合成的精神類藥品,MXE的研究歷史并不長。它的作用在2010年時首次被報道,同氯胺酮類似,包括欣快、冷靜、幻覺、感官加強(qiáng)、軀體分離、瀕死感等�，F(xiàn)今MXE的潛在危害作用還沒有被廣泛認(rèn)識,只有9個國家明令禁止使用MXE,除歐洲和美洲國家8個國家外,亞洲地區(qū)只有日本對MXE頒布了禁令。因此,在大部分國家購買MXE不需要任何憑證和授權(quán),加上互聯(lián)網(wǎng)的作用,獲取MXE甚至比KET更為容易。MXE最初是為了減少KET的泌尿系統(tǒng)毒性和其抗抑郁作用而合成的,但是,有學(xué)者2014年采用小鼠暴露于MXE,發(fā)現(xiàn)MXE對于膀胱和腎臟均有一定毒性作用�，F(xiàn)階段,關(guān)于MXE的化學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)研究有很大空白,那么MXE對于泌尿系統(tǒng)是否真的具有損害作用,迫切需要研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步說證實。為此,在本研究第二部分中,我們借鑒較為成熟的氯胺酮相關(guān)性膀胱炎動物模型,分別給予SD大鼠MXE和KET腹腔注射,研究MXE對泌尿系統(tǒng)的損害作用,并與KET引起的KC進(jìn)行比較,探討二者對于泌尿系統(tǒng)相似的作用模式。在研究的第三部分,我們采用人膀胱上皮細(xì)胞,研究MXE和KET對于刺激細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的作用。方法1.氯胺酮相關(guān)性泌尿系統(tǒng)損害的評分分期評估及臨床價值回顧性分析2009年9月至2015年9月我院收治的氯胺酮相關(guān)性泌尿系統(tǒng)損害患者的病史、實驗室和影像學(xué)資料。滿足資料齊全且符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)的患者,資料納入下一步分析,具體為：入院時均進(jìn)行病史采集、記錄膀胱日記、進(jìn)行PUF評分(Pelvic Pain and Urgency/Frequency questionnaire), ICPI (interstitial cystitis problem index)和ICSI (interstitial cystitis symptom index)評分。完善肝腎功能、B超、CT及放射性核素腎圖(Single-Photon Emission Computed Tomography, SPECT)檢查。共納入135例KAUD患者,所有患者根據(jù)膀胱和上尿路受累情況分為3期,采用階梯化的治療策略。泌尿系統(tǒng)影像學(xué)無明顯異常的患者為I期,采用行為(戒斷氯胺酮等)和藥物綜合治療(抗炎、抗組胺藥物、皮質(zhì)激素、膽堿能受體阻滯劑、腎上腺能受體阻滯劑、改善微循環(huán)藥物、對癥止痛藥物等)。影像學(xué)或尿動力提示膀胱病變,而上尿路無形態(tài)學(xué)和功能學(xué)異常為II期,在保守治療基礎(chǔ)上行膀胱水?dāng)U張術(shù)及定期堿化肝素利多卡因膀胱灌注。經(jīng)上述干預(yù)后,上尿路影像學(xué)及腎功異常持續(xù)進(jìn)展的患者為III期,在上述治療效果欠佳時考慮行腸膀胱擴(kuò)大術(shù)或膀胱全切原位新膀胱術(shù)。對患者一般資料、氯胺酮濫用史、腎功能、肝功能、影像學(xué)和尿動力學(xué)檢查結(jié)果與臨床分期的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)分析。評價治療前和治療后1個月由患者3日膀胱日記反映的平均排尿量、排尿間隔時間、夜尿次數(shù)、PUF評分、ICPI和ICSI評分。將患者氯胺酮濫用史、腎功能、肝功能、影像學(xué)提示的膀胱及上尿路病變,尿動力學(xué)檢查和腎動態(tài)顯像這7項指標(biāo)進(jìn)行分類資料轉(zhuǎn)換并建立評分系統(tǒng),分別設(shè)置評分。所有患者根據(jù)規(guī)則進(jìn)行評分,比較該評分分期與臨床分期是否相一致。繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC),檢測評分系統(tǒng)預(yù)測分期的敏感性和特異性。計算評分曲線下面積(area under roc curve, AUC)和95%CI。2.氯胺酮類似物methoxetamine引起大鼠膀胱組織炎癥和功能障礙雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠36只,體重180-220g。將36只大鼠隨機(jī)分為6組,每組6只,分別為對照1月組,對照3月組,MXE 1月組,KET 1月組,MXE 3月組和KET 3月組。每只大鼠每日腹腔注射氯胺酮溶液,注射劑量為30mg/kg,注射量根據(jù)每周大鼠體重變化進(jìn)行計算。每周采用稱重儀對所有大鼠進(jìn)行稱量,監(jiān)測體重變化。分別在1月和3月建模結(jié)束前采用代謝籠飼養(yǎng)大鼠24小時,記錄其24小時攝水量,收集大鼠24小時排出的尿液。采用代謝籠飼養(yǎng)大鼠,自由攝水取食,采用尿液顯色試紙,置于代謝籠下,觀察大鼠排尿2小時,根據(jù)試紙排尿印記觀察大鼠排尿次數(shù)和行為變化。大鼠麻醉后,硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道插入膀胱,排空膀胱內(nèi)尿液。用三通連接微量輸液泵、尿動力儀膀胱壓力傳感器和硬膜外導(dǎo)管。微量泵以0.2ml/min,向膀胱內(nèi)灌注生理鹽水,在灌注過程中觀察是否出現(xiàn)尿液溢出。當(dāng)膀胱壓力升高且有尿液排出時,此時的膀胱收縮為正常收縮,膀胱壓力為排尿時膀胱最大壓力(Maximum pressure,MP),膀胱最大容量(Maximum cystometric capacity, MCC)為灌注時間乘以灌注速度。當(dāng)膀胱壓力升高而沒有排尿行為時,此時的膀胱收縮為逼尿肌不穩(wěn)定收縮(Non-voiding Contraction)。每只老鼠至少連續(xù)測定5個排尿周期以上。在最后一次排尿后,通過注射器連接導(dǎo)管抽出膀胱殘余尿,即為殘余尿量(Post Void Residual, PVR)。處死大鼠后取膀胱,組織放入液氮中保存。制作石蠟切片,進(jìn)行HE染色、阿利新藍(lán)染色、甲苯胺藍(lán)染色和masson染色。Western Blot法驗證膀胱組織a-SMA, Collagen I, Fibronectin表達(dá)豐度。熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子、趨化因子和纖維化相關(guān)產(chǎn)物(IL-1,IL-6,CCL-2,CXCL-1,CXCL-10,NGF, TGF-β,a-SMA, Collagen I, Collagen III和Fibronectin)。3.氯胺酮類似物Methoxetamine對人膀胱上皮細(xì)胞的作用培養(yǎng)SV-HUC-1細(xì)胞,采用Cell Counting Kit-8試劑盒,細(xì)胞鋪板后加入含有0、0.125mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM、2mM、4mM和8mM濃度梯度的MXE/KET溶液,孵育24小時和48小時后加入CCK-8溶液,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時后用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度,計算各孔細(xì)胞活力。熒光定量PCR檢測Methoxetamine和Ketamine刺激細(xì)胞后產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子(IL-1,IL-6,CCL-2,CXCL-1,CXCL-10,NGF和TGF-p)。結(jié)果1.雙變量相關(guān)分析顯示,患者年齡、氯胺酮濫用時長、排尿間隔時間、夜尿次數(shù)、PUF評分、ICPI評分、ICSI評分同患者的臨床分期相關(guān)。在輔助檢查中,eGFR (r=-0.274, P=0.001)、ALT (r=0.18, P=0.037)、γ-GT (r=0.456, P0.001)、膀胱壁增厚(r=0.238,P=0.013)、輸尿管病變(r=0.509,P0.001)、腎積水(r=0.522,P0.001)和核素腎圖的異常比例(r=0.287,P=0.01)與臨床分期呈不同程度的相關(guān)關(guān)系,而尿動力檢查的結(jié)果提示臨床分期與膀胱感覺敏感(r=0.419,P0.001)和逼尿肌改變(過度活動或活動低下,r=0.704,P0.001)的比例呈正相關(guān)。在經(jīng)過方法所述的方案治療后,3期患者的排尿間隔時間有所延長,平均排尿量明顯增加,夜尿次數(shù)減少,PUF評分、ICPI和ICSI評分較治療前明顯下降(P0.05)。39例臨床I期患者得分為(4.92±1.94)分,其中30例(76.9%)仍被診斷為I期,而9例(22.1%)判為Ⅱ期。臨床Ⅱ期患者得分為(8.79±2.16)分,其中65例(81.2%)仍被診斷為Ⅱ期,12例(15.0%)被錯判為Ⅰ期,3例(3.75%)被錯判為Ⅲ期。臨床Ⅲ期患者得分為(14.6±2.25)分,12例(75.0%)被正確診斷為Ⅲ期,4例(25.0%)被歸為Ⅱ期。135例中共有107例(79.2%)由評分得出的分期與臨床分期相同,而28例(20.7%)評分分期與臨床分期不符合。該評分系統(tǒng)在判斷Ⅰ期和Ⅱ期臨界值(即評分6分為臨界值)時,評分ROC的AUC為0.922,95%CI為0.879～0.965(圖1A),而當(dāng)判斷Ⅱ期和Ⅲ期臨界值(即評分12分為臨界值)時,評分ROC的AUC為0.978,95%CI為0.952-1.000(圖1B)。2.大鼠經(jīng)過1個月和3個月的MXE和KET腹腔注射后,體重增加明顯少于對照組,而MXE更加明顯。24H的飲水量和尿量,對照組、MXE和KET組在1月和3月時均沒有明顯差異。1月時,MXE和KET組大鼠排尿次數(shù)較對照組明顯增多。而3月時,MXE和KET組大鼠排尿次數(shù)明顯多于對照組,而KET組尿頻程度較MXE組更為嚴(yán)重。大鼠的尿動力學(xué)顯示,長期使用MXE和KET后,大鼠的排尿次數(shù)、逼尿肌不穩(wěn)定收縮、膀胱最大壓力明顯增高,而膀胱最大容量、膀胱順應(yīng)性、排尿量和排尿效率明顯降低,且隨接觸藥物時間延長而更加嚴(yán)重。大鼠膀胱組織的HE染色提示,MXE和KET組出現(xiàn)了上皮層變薄甚至缺失,固有層和黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤,存在不同程度的血管擴(kuò)張,而對照組未發(fā)現(xiàn)類似的變化。阿里新藍(lán)染色反映了MXE和KET組上皮層的糖蛋白含量明顯低于對照組,而MXE和KET組之間明顯明顯差異。甲苯胺藍(lán)染色實驗顯示MXE和KET組巨噬細(xì)胞浸潤比例增高。馬松染色發(fā)現(xiàn)了同對照組相比,MXE和KET組大鼠膀胱肌層中膠原表達(dá)明顯增高,而二者之間沒有明顯差異。Western Blot顯示MXE和KET組大鼠膀胱組織a-SMA, Collagen I, Fibronectin表達(dá)豐度較對照組明顯增強(qiáng)。熒光定量PCR證實促炎性因子、趨化因子和纖維化相關(guān)產(chǎn)物(IL-1,IL-6,CCL-2,CXCL-1,CXCL-10,NGF, TGF-β,a-SMA, Collagen I, Collagen III和Fibronectin)均有不同程度的升高,且MXE 3月和KET 3月組較1月組升高更為明顯。3. SV-HUC-1細(xì)胞在使用MXE和KET刺激24小時和48小時后,細(xì)胞活性逐漸隨MXE和KET的濃度升高而降低。在MET和KET分別為0.25和0.5mM時,SV-HUC-1細(xì)胞活性同PBS對照組相比,活性約為80%。因此認(rèn)為此濃度對細(xì)胞活性無明顯致死影響,可用于下一步實驗。SV-HUC-1細(xì)胞在0.25和0.5mM的MXE和KET刺激24和48小時后,qPCR顯示細(xì)胞因子IL-1,IL-6,CCL-2,CXCL-1,CXCL-10,NGF,TGF-p表達(dá)水平明顯升高,氧化應(yīng)激標(biāo)記物COX-2也出現(xiàn)了表達(dá)上升。結(jié)論1.通過氯胺酮濫用史、實驗室檢驗及影像學(xué)檢查對氯胺酮相關(guān)性泌尿系統(tǒng)損害的評分分期系統(tǒng),可能有助于評估膀胱及上尿路病情發(fā)展階段,對治療方式的選擇有一定的指導(dǎo)作用。該評分系統(tǒng)仍有待于進(jìn)一步驗證和完善。2.氯胺酮類似物methoxetamine能夠引起大鼠尿頻、膀胱容量減少、順應(yīng)性降低和逼尿肌不穩(wěn)定收縮等膀胱功能障礙。3.大鼠膀胱組織病理證實methoxetamine導(dǎo)致膀胱部分上皮缺失、上皮表面糖蛋白減少、黏膜下炎性細(xì)胞浸潤和血管增生擴(kuò)張,肌層出現(xiàn)膠原沉積,并伴隨纖維化相關(guān)產(chǎn)物上調(diào),與氯胺酮對膀胱損害的病理特點相似。4.長期接觸Methoxetamine的大鼠出現(xiàn)膀胱組織炎癥,組織中多種促炎性因子和趨化因子(IL-1,IL-6,CCL-2,CXCL-1,CXCL-10,NGF, TGF-β)表達(dá)水平增高。5. Methoxetamine刺激人膀胱上皮細(xì)胞后,也會直接刺激細(xì)胞引起上述細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生明顯增多。
【關(guān)鍵詞】：氯胺酮 臨床分期 評分系統(tǒng) Methoxetamine 膀胱炎 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R694.5
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 第一部分 前言22-24
• 第二部分 氯胺酮相關(guān)性泌尿系統(tǒng)損害的評分分期評估及臨床價值24-35
• 第一節(jié) 對象與方法24-27
• 1.1 入組條件24
• 1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)24
• 1.3 患者一般資料24
• 1.4 臨床分期和干預(yù)24-25
• 1.5 評價指標(biāo)25
• 1.6 分期系統(tǒng)建立25-26
• 1.7 統(tǒng)計學(xué)方法26-27
• 第二節(jié) 結(jié)果27-32
• 第三節(jié) 討論32-35
• 第三部分 氯胺酮類似物methoxetamine引起大鼠膀胱組織炎癥和功能障礙35-61
• 第一節(jié) 主要儀器設(shè)備和試劑35-36
• 1.1 主要儀器35
• 1.2 主要試劑35-36
• 第二節(jié) 實驗方法36-43
• 2.1 實驗動物及分組36
• 2.2 模型建立36
• 2.3 行為學(xué)觀察36
• 2.4 大鼠膀胱測壓36-37
• 2.5 取材與切片制作37-38
• 2.6 組織切片染色38-39
• 2.7 免疫組化實驗檢測α-SMA,Collagen Ⅰ,Fibronectin在膀胱組織中的表達(dá)39-40
• 2.8 熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子、趨化因子和纖維化相關(guān)產(chǎn)物40-43
• 2.9 統(tǒng)計方法43
• 第三節(jié) 實驗結(jié)果43-57
• 3.1 行為學(xué)改變43-45
• 3.2 大鼠膀胱測壓結(jié)果45-51
• 3.3 組織切片染色改變51
• 3.4 免疫組化實驗證實膀胱組織上調(diào)α-SMA,Collagen Ⅰ,Fibronectin51-52
• 3.5 熒光定量PCR證實細(xì)胞因子、趨化因子和纖維化相關(guān)產(chǎn)物表達(dá)升高52-57
• 第四節(jié) 討論57-61
• 第四部分 氯胺酮類似物Methoxetamine對人膀胱上皮細(xì)胞的作用61-73
• 第一節(jié) 主要儀器設(shè)備和試劑61-62
• 1.1 細(xì)胞系61
• 1.2 主要儀器61
• 1.3 主要試劑61-62
• 1.4 其他試劑配制62
• 第二節(jié) Methoxetamine和Ketamine對于膀胱上皮細(xì)胞的毒性作用62-65
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)62-63
• 2.2 CCK-8實驗原理63
• 2.3 實驗步驟63-64
• 2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計64
• 2.5 實驗結(jié)果64-65
• 第三節(jié) 熒光定量PCR檢測Methoxetamine和Ketamine刺激細(xì)胞后產(chǎn)生促炎性因子和趨化因子65-68
• 3.1 所用引物65-66
• 3.2 實驗步驟66-67
• 3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計67
• 3.4 實驗結(jié)果67-68
• 第四節(jié) 討論68-73
• 全文總結(jié)73-74
• 參考文獻(xiàn)74-80
• 碩士研究生期間參與發(fā)表論文情況80-81
• 致謝81-83

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王強(qiáng);氯胺酮及衍生物Methoxetamine引起膀胱功能障礙的機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號：565317