本文關(guān)鍵詞：HVJ-E致PC3細胞凋亡的作用機制

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【摘要】：前列腺癌是最常見的惡性腫瘤。在美國,前列腺癌是引起男性死亡率第二高的癌癥。前列腺癌發(fā)展緩慢,它是雄激素依賴性生長腫瘤。雄激素阻斷后,前列腺癌會出現(xiàn)消退。后來出現(xiàn)了激素抵抗型癌細胞株,可抵抗常規(guī)治療手段并最終導(dǎo)致死亡。因此,開展新型的治療方法來治療激素抵抗型前列腺癌尤為重要。研究表明,滅活仙臺病毒(Hemaglutinating virus of Japan Envelope, HV J-E)不僅可以作為載體傳遞抗腫瘤藥物,激活多重抗腫瘤免疫,同時還能直接殺傷腫瘤。本研究中,我們使用HVJ-E來誘導(dǎo)人前列腺癌細胞產(chǎn)生凋亡及自噬,并初步探討了其可能的作用機制。首先,我們用HVJ-E處理PC3細胞,倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),細胞出現(xiàn)生長停滯、皺縮和破裂的現(xiàn)象,FACS檢測顯示,經(jīng)HVJ-E處理后,PC3細胞均產(chǎn)生明顯的凋亡,且呈劑量依賴關(guān)系,提示HVJ-E可直接導(dǎo)致PC3細胞凋亡。為探討HVJ-E致PC3細胞凋亡的作用機制,我們用Western Blot法檢測了Caspase信號通路的相關(guān)蛋白,結(jié)果表明,隨著HVJ-E濃度的升高,caspase-9、caspase-3、PARP均被有效激活。為進一步驗證caspase通路在HVJ-E致PC3細胞凋亡中的作用,我們以廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理細胞后再用HVJ-E處理,結(jié)果顯示,caspase-3的活化被顯著抑制,同時FACS檢測結(jié)果也表明,Z-VAD-FMK可顯著抑制HVJ-E誘導(dǎo)的凋亡率。為進一步探究HVJ-E致PC3細胞凋亡的作用機制,我們以Western Blot法檢測了MAPK信號通路中的3個主要亞族,結(jié)果表明p38、JNK和Erkl/2均被激活。為進一步確認MAPK通路在HVJ-E致PC3細胞凋亡中的作用,我們分別利用p38抑制劑SB203580(10μM)、JNK抑制劑SP600125 (7.5μM)、Erk1/2抑制劑U0126 (20μM)預(yù)處理細胞30分鐘后,再以HVJ-E處理PC3細胞,Western Blot結(jié)果顯示,p38、JNK和Erk1/2的激活均被顯著抑制。同時,FACS和CCK-8的檢測結(jié)果也表明,各抑制劑可下調(diào)HVJ-E誘導(dǎo)的細胞凋亡,并減少HVJ-E導(dǎo)致的細胞死亡,證實了MAPK在HVJ-E誘導(dǎo)的PC3細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。為深入探明HVJ-E激活MAPK信號通路的可能機制,我們測定了HVJ-E處理PC3細胞后活性氧(ROS)的產(chǎn)生水平,結(jié)果顯示,隨著HVJ-E濃度的升高,PC3產(chǎn)生ROS的水平也升高,說明HVJ-E可刺激細胞產(chǎn)生ROS。為研究ROS在HVJ-E激活MAPK通路中的作用,我們以活性氧清除劑(NAC)預(yù)處理PC3細胞30分鐘,然后加入HVJ-E作用24小時。再經(jīng)FACS法檢測細胞凋亡率,Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果顯示,NAC能抑制HVJ-E誘導(dǎo)的凋亡率；同時,NAC能抑制MAPK信號通路中JNK、Erkl/2、P38蛋白的磷酸化,提示ROS可能是HVJ-E激活MAPK信號通路,并最終導(dǎo)致PC3細胞凋亡的主要因素。自噬在細胞死亡中發(fā)揮重要作用,為研究HVJ-E是否可引起PC3細胞自噬,我們利用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC3細胞,觀察自噬小體,并通過LC3I/II的轉(zhuǎn)化計算,證實HVJ-E可誘導(dǎo)PC3細胞自噬。PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路對自噬為負調(diào)控,而III型PI3K/becline-1則對自噬形成正調(diào)控,Western Blot結(jié)果顯示,經(jīng)HVJ-E處理后,AKT、mTOR、p70S6K被激活,同時Becline-1的表達也隨著HVJ-E的處理而增強。由此說明PI3K/Becline-1參與了HVJ-E引起的細胞自噬。為進一步研究自噬在HVJ-E致PC3細胞凋亡中的作用,我們分別利用自噬誘導(dǎo)劑Rapa和自噬抑制劑CQ分別預(yù)處理PC3細胞,然后再以HVJ-E進行刺激,FACS和CCK-8結(jié)果表明,RAPA可提高HVJ-E致PC3細胞的凋亡率(p0.01),而CQ對HVJ-E致PC3細胞凋亡率沒有影響(p0.05); Western Blot檢測結(jié)果顯示,與HVJ-E組對照組相比,HVJ-E+Rapa組可進一步提高JNK、Erk1/2和p38的磷酸化水平,并促進caspase-3的裂解,提示促進自噬,可提高HVJ-E引起的PC3細胞凋亡率,這也為研究HVJ-E致腫瘤細胞凋亡的研究提供了新的借鑒。
【關(guān)鍵詞】：滅活仙臺病毒 PC3 凋亡 自噬
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 符號說明10-11
• 文獻綜述11-20
• 1 仙臺病毒基本概述12-14
• 1.1 仙臺病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)12
• 1.2 仙臺病毒的分子生物學(xué)特征12-13
• 1.3 仙臺病毒生物學(xué)功能發(fā)揮方式13
• 1.4 仙臺病毒調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答13-14
• 1.5 仙臺病毒研究展望14
• 2 細胞凋亡14-17
• 2.1 細胞凋亡的分子機理14
• 2.2 細胞凋亡的特征14-17
• 3 細胞自噬17-20
• 3.1 自噬的形成17
• 3.2 自噬的分類17-18
• 3.2.1 巨自噬18
• 3.2.2 分子伴侶介導(dǎo)的自噬18
• 3.2.3 微自噬18
• 3.3 自噬在腫瘤中的作用18-20
• 3.3.1 自噬的兩面性18-19
• 3.3.2 自噬的免疫研究19-20
• 第一部分 HVJ-E致PC3凋亡的作用機制20-37
• 1 材料20-21
• 1.1 細胞株、病毒20
• 1.2 主要實驗儀器20-21
• 1.3 主要試劑和藥品21
• 2 方法21-29
• 2.1 溶液配制22
• 2.2 滅活仙臺病毒的制備22-23
• 2.2.1 仙臺病毒的繁殖22
• 2.2.2 仙臺病毒的濃縮22-23
• 2.2.3 仙臺病毒效價的測定23
• 2.2.4 仙臺病毒的滅活及感染力的驗證23
• 2.3 PC3細胞的培養(yǎng)23-24
• 2.4 觀察細胞形態(tài)24
• 2.5 CCK-8法測定細胞的生長抑制效果24
• 2.6 FACS(Annexin V/PI雙染法)檢測細胞凋亡24-25
• 2.7 FACS(探針DCFH-DA)檢測細胞活性氧25
• 2.8 Western blot檢測細胞凋亡蛋白的表達25-28
• 2.8.1 蛋白樣品制備25
• 2.8.2 測蛋白濃度25-26
• 2.8.3 蛋白樣品變性26
• 2.8.4 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳26-27
• 2.8.5 轉(zhuǎn)膜27
• 2.8.6 免疫反應(yīng)27-28
• 2.8.7 化學(xué)發(fā)光、曝光28
• 2.9 檢測Caspase信號通路相關(guān)蛋白28
• 2.10 檢測Z-VAD-FMK預(yù)處理后細胞的凋亡和Caspase-3蛋白28
• 2.11 檢測MAPK信號通路相關(guān)蛋白28
• 2.12 檢測MAPK通路各個抑制劑預(yù)處理后細胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白28-29
• 2.13 檢測NAC預(yù)處理后細胞的凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白29
• 3. 結(jié)果29-35
• 3.1 HVJ-E對PC3細胞增殖活性的影響29-30
• 3.2 HVJ-E對PC3細胞凋亡的影響30-31
• 3.3 Caspase信號通路在HVJ-E致PC3細胞凋亡中發(fā)揮作用31-32
• 3.4 MAPK信號通路在HVJ-E致PC3細胞凋亡中發(fā)揮作用32-33
• 3.5 測定了PC3細胞的凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的表達33-35
• 4. 討論35-37
• 第二部分 自噬在HVJ-E致PC3凋亡中的作用37-42
• 1. 材料37-38
• 1.1 細胞株、病毒37
• 1.2 主要實驗儀器37-38
• 1.3 主要試劑和藥品38
• 2. 方法38-39
• 2.1 溶液配制38
• 2.2 細胞免疫熒光觀察自噬小體38
• 2.3 Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白38-39
• 2.4 檢測caspase-3、PARP、LC3的表達39
• 2.5 檢測細胞凋亡率39
• 3. 結(jié)果39-41
• 3.1 HVJ-E可誘導(dǎo)PC3細胞發(fā)生自噬39-40
• 3.2 誘導(dǎo)自噬可促進HVJ-E致PC3細胞凋亡的效應(yīng)40-41
• 4. 討論41-42
• 全文結(jié)論42-43
• 參考文獻43-52
• 致謝52-53

【參考文獻】

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本文編號：526148