本文關(guān)鍵詞：系膜細(xì)胞中TIMP-1調(diào)控單核細(xì)胞趨化因子CCL2和分化因子PAQRB的機(jī)制研究

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【摘要】：背景：系膜增殖性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MesPGN)是根據(jù)病理學(xué)形態(tài)來定義的疾病,包括IgA腎病和非IgA腎病。系膜增殖性腎炎經(jīng)典的動物模型是抗Thy-1腎炎模型,分為系膜溶解期,系膜增殖期,系膜增殖恢復(fù)期。細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue inhibitors of Metalloproteinases, TIMPs)是基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)的內(nèi)源性抑制劑,它作為細(xì)胞因子發(fā)揮非MMPs依賴的對細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)控。前期工作中,大鼠抗Thy-1腎炎模型基因芯片檢測結(jié)果顯示,TIMP-1和細(xì)胞因子C-C chemokine ligand 2 (CCL2)的表達(dá)水平在系膜溶解期開始上調(diào),系膜增殖期達(dá)到高峰,在增殖恢復(fù)期又逐漸降低。CCL2是將單核巨噬細(xì)胞募集至炎癥部位的細(xì)胞因子,NF-κB作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,能夠促進(jìn)CCL2在多種細(xì)胞的表達(dá)。因此我們推斷TIMP-1可能通過NF-κB介導(dǎo)CCL2上調(diào),從而調(diào)控系膜溶解期和系膜增殖期的免疫炎癥反應(yīng)。單核巨噬細(xì)胞分化因子(Monocyte to macrophage differentiation-associated, MMD)王要由MMD基因(PAQRB基因)編碼,主要功能為誘導(dǎo)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化。我們推斷在系膜增殖性腎小球腎炎中,TIMP-1通過NF-κB上調(diào)CCL2的表達(dá),促進(jìn)單核細(xì)胞在炎癥部位的募集,并通過促進(jìn)PAQRB的表達(dá),將單核細(xì)胞分化為單核巨噬細(xì)胞,參與免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。目的：利用Taqman探針技術(shù)驗(yàn)證TIMP-1和CCL2在大鼠抗Thy-1腎炎中的表達(dá)水平變化；利用Taqman探針法和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測TIMP-1對細(xì)胞因子CCL2的調(diào)控作用；阻斷高表達(dá)系膜細(xì)胞模型中NF-κB的水平并驗(yàn)證下游CCL2的表達(dá)變化；利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)得到TIMP-1高表達(dá)時的下游差異基因表達(dá)譜；利用Taqman探針法驗(yàn)證下游差異基因PAQRB的mRNA表達(dá)水平。方法：(1)制備大鼠抗Thy-1腎炎模型,分別在第0天(對照組)、第1天、第3天、第4天、第5天、第7天(均為模型組)處死大鼠,研磨得到腎小球。利用Taqman探針法檢測TIMP-1和CCL2在抗Thy-1腎炎各個時間點(diǎn)的表達(dá)水平。(2)利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)建立TIMP-1高表達(dá)與低表達(dá)的大鼠系膜細(xì)胞(RMC)模型。利用GFP-TIMP-1慢病毒轉(zhuǎn)染RMC的方法建立高表達(dá)模型,并于第3天起觀察細(xì)胞熒光表達(dá)；設(shè)計TIMP-1小干擾RNA序列并利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建低表達(dá)模型。(3)收集TIMP-1高表達(dá)RMC模型第6天的細(xì)胞和TIMP-1氏表達(dá)模型中第48小時的細(xì)胞,利用Taqman法和蛋白印跡法(Werstern blot)檢測TIMP-1, MMP2, MMP9, NF-κB和CCL2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。(4)在TIMP-1高表達(dá)系膜細(xì)胞模型第4天加入NF-kB阻斷劑BAY11-7082 (5μmol/L),培育48小時后,提取細(xì)胞RNA。利用Taqman探針法檢測CCL2的mRNA表達(dá)水平變化。(5)對TIMP-1高表達(dá)系膜細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,得到差異基因表達(dá)譜,利用生物信息學(xué)分析關(guān)鍵基因PAQRB的作用。(6)利用RT-PCR去驗(yàn)證PAQRB在TIMP-1高表達(dá)與低表達(dá)模型中的表達(dá)。結(jié)果：(1)在大鼠抗Thy-1腎炎模型中,TIMP-1和CCL2的表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高再恢復(fù)正常的趨勢,其中TIMP-1在第3天,第5天和第7天升高明顯,第5天達(dá)到峰值。CCL2在第2天達(dá)到峰值。(2)成功建立TIMP-1高表達(dá)與低表達(dá)的大鼠系膜細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)染后表達(dá)熒光的效率達(dá)90%。(3)TIMP-1表達(dá)升高時,MMP9,NF-κB和CCL2的表達(dá)顯著升高(P0.05)；反之當(dāng)TIMP-1表達(dá)降低時,MMP9,NF-κB和CCL2表達(dá)顯著降低(P0.05)。MMP2的變化則不明顯。(4)當(dāng)阻斷NF-κB48小時后,TIMP-1高表達(dá)系膜細(xì)胞模型中CCL2明顯降低(P0.05)。(5)TIMP-1調(diào)控許多與細(xì)胞增殖／凋亡、細(xì)胞分化、免疫炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的蛋白,參與系膜增殖性腎小球腎炎的免疫炎癥反應(yīng)。TIMP-1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞分化因子(PAQRB)的分泌,后者促進(jìn)單核細(xì)胞的分化。(6)TIMP-1表達(dá)升高時,PAQRB的表達(dá)顯著升高(P0.05)；反之當(dāng)TIMP-1表達(dá)降低時,PAQRB表達(dá)顯著降低(P0.05)。結(jié)論：在大鼠系膜細(xì)胞中,TIMP-1可以通過激活NF-κB信號通路調(diào)控單核細(xì)胞趨化因子CCL2,促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞分化因子PAQRB的分泌,參與系膜增殖性腎小球腎炎的免疫炎癥反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：系膜增殖性腎小球腎炎 TIMP-1 NF-κB CCL2 PAQRB
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R692.31
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 第一部分：TIMP-1和CCL2在大鼠抗Thy-1腎炎中的表達(dá)11-23
• 前言11-13
• 第一節(jié) 大鼠抗Thy-1腎炎模型的建立13-19
• —、材料與方法13-16
• 二、結(jié)果16-17
• 三、討論17
• 四、結(jié)論17-19
• 第二節(jié) 大鼠抗Thy-1腎炎模型中TIMP-1和CCL2的表達(dá)19-23
• 一、材料與方法19-21
• 二、結(jié)果21-22
• 三、討論22
• 四、結(jié)論22-23
• 第二部分 TIMP-1調(diào)控NF-κB-CCL2通路和PAQRB的機(jī)制研究23-53
• 前言23-25
• 第一節(jié) TIMP-1不同表達(dá)水平系膜細(xì)胞模型的建立25-31
• —、材料與方法25-27
• 二、結(jié)果27-29
• 三、討論29
• 四、結(jié)論29-31
• 第二節(jié) TIMP-1調(diào)控NF-κB-CCL2通路的作用機(jī)制研究31-41
• 一、材料與方法31-34
• 二、結(jié)果34-37
• 三、討論37-39
• 四、結(jié)論39-41
• 第三節(jié) TIMP-1調(diào)控單核巨噬細(xì)胞分化因子PAQRB的研究41-53
• 一、材料與方法41-43
• 二、結(jié)果43-48
• 三、討論48-51
• 四、結(jié)論51-53
• 全文總結(jié)53-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 文獻(xiàn)綜述61-75
• 參考文獻(xiàn)70-75
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文75-76
• 致謝76

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 鄭玉玲;田力;;基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1小干擾RNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J];世界中西醫(yī)結(jié)合雜志;2007年06期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 呂楊;抗Thy-1腎炎模型基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)表達(dá)譜研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2010年

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本文編號：513918