本文關(guān)鍵詞：PHD鋅指蛋白14在腎間質(zhì)纖維化中的作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的:研究在急性損傷后腎纖維化過程中,腎組織PHD鋅指蛋白14(PHF14)的表達變化規(guī)律和該PHF14在急性損傷后腎纖維化中的作用,并對其可能機制進行探究。方法:1.建立小鼠葉酸性腎病模型,利用Masson染色病理切片和collagen 1、alpha-SMA免疫組化染色驗證模型制作成功。以實時PCR技術(shù)與免疫印跡技術(shù)檢測PHF14蛋白在腎臟處于急性損傷和后續(xù)纖維化進展狀態(tài)下的表達規(guī)律。2.雜交培育PHF14條件敲除小鼠,再應用他莫昔芬實施PHF14敲除并驗證敲除成功。3.給予PHF14敲除成功小鼠和未經(jīng)PHF14敲除小鼠葉酸刺激,利用免疫印跡技術(shù),Masson染色病理切片和collagen 1、alpha-SMA免疫組化染色比較PHF14敲除組與PHF14非敲除組纖維化程度。4.以實時PCR技術(shù)與免疫印跡技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測經(jīng)TGF-beta刺激的大鼠腎間質(zhì)成纖維細胞(NRK-49F)的PHF14表達變化規(guī)律。5.在TGF-beta刺激NRK-49F之前采用smad2/3磷酸化抑制劑SB431542抑制smad2/3磷酸化后以實時PCR技術(shù)、免疫印跡技術(shù)檢測PHF14表達變化規(guī)律是否與未加抑制劑前相同。并采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)驗證smad2/3與PHF14啟動子區(qū)是否有結(jié)合位點。6.應用PHF14的siRNA干擾NRK-49F的PHF14表達后采用免疫印跡和免疫熒光技術(shù)檢測纖維化指標collagen 1和alpha-SMA表達情況。7.PHF14 siRNA干擾NRK-49F組和隨機RNA干擾NRK-49F組分別以實時PCR和免疫印跡技術(shù)檢測PDGFR-alpha的表達。并且采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)驗證前人研究結(jié)果中PHF14結(jié)合于PDGFR-alpha啟動子位置。結(jié)果:1.腎臟受到葉酸的促纖維化刺激后PHF14表達在mRNA水平上和蛋白水平上都持續(xù)增加,通過雜交成功培育了PHF14誘導敲除小鼠。在小鼠成年后使用他莫昔芬誘導PHF14敲除不能造成胚胎期即敲除PHF14小鼠的廣泛纖維化表型,也不會致死。成年小鼠在誘導PHF14敲除后遭受葉酸刺激的慢性纖維化期其腎臟纖維化程度會更加嚴重。2.在細胞水平上,TGF-beta刺激可以上調(diào)NRK-49F細胞PHF14的表達,其機制是通過TGF-beta/p-smad3直接啟動PHF14的轉(zhuǎn)錄。而PHF14又能和其他蛋白構(gòu)成復合體以相同的方式直接抑制PDGFR-alpha的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論:在葉酸性腎病中,PHF14蛋白表達隨著纖維化程度進展持續(xù)上調(diào)。PHF14的高表達是由TGF-beta/p-smad3介導的。上調(diào)的PHF14能抑制纖維化的進展,其機制是通過抑制PDGFR-alpha的轉(zhuǎn)錄。TGF-beta/p-smad3/PHF14通路可被視作TGF-beta所主導的腎促纖維化信號通路的自限性機制和促纖維化-抑制纖維化再平衡通路。
【關(guān)鍵詞】：PHF14 腎纖維化 TGF-beta 間質(zhì)成纖維細胞
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 縮略詞表9-11
• 前言11-12
• 第一部分 葉酸性腎病小鼠模型中PHF14的表達規(guī)律及其對纖維化進展的作用12-32
• 前言12-13
• 實驗設(shè)計13-15
• 材料與方法15-25
• 結(jié)果25-30
• 討論30-32
• 第二部分 TGF-BETA刺激成纖維細胞時PHF14的表達變化及其在成纖維細胞活化過程中的作用32-50
• 前言32-33
• 實驗設(shè)計33-35
• 材料與方法35-42
• 結(jié)果42-48
• 討論48-50
• 全文總結(jié)50-51
• 參考文獻51-54
• 綜述 TGF-beta 在腎纖維化中的作用54-59
• 參考文獻56-59
• 在讀期間完成和發(fā)表的文章59-60
• 致謝60

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9 荊U，

本文編號：419132