目的:構建重組人組織激肽釋放酶7(KLK7)表達載體,建立穩(wěn)定過表達KLK7的前列腺癌細胞株PC-3,并研究其細胞侵襲性。方法:將擴增后的KLK7cDNA克隆到表達載體pcDNA3.1上;使用限制性內切酶酶切后,DNA測序驗證。然后,通過脂質體法轉染人前列腺癌細胞株PC-3;選用G418進行篩選,并擴大培養(yǎng)每個單克隆細胞,進而建立穩(wěn)定轉染后的KLK7單克隆細胞株PC-3;Western blot檢測目的蛋白的表達。通過細胞侵襲性試驗了解其細胞侵襲性。結果:①通過酶切鑒定、DNA測序分析并證明,成功構建pcDNA3.1-KLK7表達載體;②成功獲得穩(wěn)定過表達KLK7的前列腺癌單克隆細胞株PC-3;③Western blot結果顯示:經過pcDNA3.1-KLK7轉染后的細胞與未轉染的細胞表達量比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01);④細胞侵襲性試驗結果顯示:轉染后的細胞侵襲性高于未轉染的細胞。結論:成功的建立pcDNA3.1-KLK7表達載體及穩(wěn)定過表達KLK7的前列腺癌PC-3單克隆細胞株,同時證明其細胞侵襲性,為研究KLK7在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定了基礎。

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圖1pcDNA3.1-KLK7結構及酶切位點位置示意圖

取抽提后質粒實施酶切(KpnI限制性內切酶),載體構圖(圖1)。因KLK7開放讀碼框、pcDNA3.1載體上各存在1個酶切位點,因此酶切插入方向正確后電泳條帶顯示686bp(圖2)。對預期相符質粒DNA測序驗證。圖2載體KpnI限制性內切酶酶切電泳圖

圖2載體KpnI限制性內切酶酶切電泳圖

圖1pcDNA3.1-KLK7結構及酶切位點位置示意圖2PC-3穩(wěn)定轉染細胞株的KLK7表達鑒定

圖3轉染細胞及空載體細胞hK7表達比較

KLK7的細胞侵襲性試驗結果表明(圖3),40倍鏡放大下5個隨機視野,轉染的PC-3-KLK7細胞組平均細胞計數(shù)為(246.60±23.41)個/HP,對照的PC-3細胞組平均細胞計數(shù)為(109.00±8.75)個/HP,兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖4)。圖4....

圖4前列腺癌PC-3單克隆細胞株穩(wěn)定過表達KLK7的細胞侵襲試驗(結晶紫染色,×40倍)

圖3轉染細胞及空載體細胞hK7表達比較討論

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