目的:通過分析熱休克蛋白40家族成員Dnajb13在成年小鼠生精細(xì)胞中的定位,研究其mRNA和蛋白在隱睪小鼠睪丸中表達(dá)量和定位的變化情況,初步探討其在生精細(xì)胞凋亡中的作用。方法:手術(shù)建立單側(cè)隱睪小鼠模型,采用免疫組化方法研究Dnajb13在小鼠生精細(xì)胞中的定位;采用TUNEL、流式細(xì)胞檢測結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察確認(rèn)小鼠隱睪模型是否建立成功,并分析生精細(xì)胞凋亡情況;采用qPCR、Western印跡以及免疫組化分析隱睪手術(shù)后第1、2、3、4、6、9和15天與正常側(cè)相比隱睪側(cè)Dnajb13 mRNA和蛋白的表達(dá)及定位變化情況。結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示在成熟小鼠正常睪丸組織中,Dnajb13表達(dá)于生精上皮周期Ⅸ～ⅩⅥ期長形精子中;成功構(gòu)建隱睪小鼠模型。TUNEL結(jié)合流式細(xì)胞檢測表明I期圓形精子以及分裂期初級(jí)精母細(xì)胞對溫度升高最敏感,隱睪模型手術(shù)后最早發(fā)生凋亡的生精細(xì)胞是圓形精子細(xì)胞(Ⅰ～Ⅷ期),從17.09%降為6.52%(P<0.05),隨后是變形期精子細(xì)胞(Ⅸ～ⅩⅥ期),最后為初級(jí)精母細(xì)胞;qPCR結(jié)果顯示術(shù)后第3天Dnajb13 mRNA表達(dá)量輕微上升,約為正常側(cè)的1.6倍(P<0.0...

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圖1免疫組化檢測DNAJB13在小鼠生精上皮中的表達(dá)模式(免疫組化,×100)

結(jié)果顯示Dnajb13開始表達(dá)于Ⅸ期的S9期長形精子細(xì)胞胞質(zhì)中,其蛋白表達(dá)量在S13～S14期的長形精子細(xì)胞中達(dá)到高峰,隨后隨著S15～S16期長形精子細(xì)胞甩脫胞質(zhì),Dnajb13在精子胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)量開始下降,最終只在S16期精子細(xì)胞殘留的胞質(zhì)小滴以及精子尾部還可以檢測到Dnaj....

圖2隱睪模型手術(shù)后小鼠睪丸外觀、重量以及生精小管直徑的變化

隱睪手術(shù)后第4天睪丸外觀發(fā)生變化,第15天時(shí)顯著縮小(圖2A)。睪丸質(zhì)量從術(shù)后第4天起開始下降,約為正常側(cè)的0.8倍(P<0.05),到第9天只有正常側(cè)的0.37倍(P<0.05),第9～15天內(nèi)睪丸質(zhì)量下降幅度變小,第15天的睪丸質(zhì)量約為正常側(cè)的0.31倍(圖2B)。隱睪側(cè)....

圖3TUNEL檢測隱睪小鼠睪丸組織

隱睪模型手術(shù)后處于不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞逐步發(fā)生凋亡,術(shù)后第1～3天TUNEL檢測結(jié)果顯示:Ⅰ階段和Ⅻ階段的生精小管內(nèi)有部分圓形精子和少量分裂期初級(jí)精母細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖3B～D),流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示:單倍體精子細(xì)胞比例顯著下降,從17.09%降為6.52%,差異顯著(P<0....

圖4隱睪手術(shù)后流式細(xì)胞檢測生精細(xì)胞細(xì)胞DNA含量

圖3TUNEL檢測隱睪小鼠睪丸組織2.4Dnajb13mRNA在隱睪側(cè)睪丸組織中的表達(dá)

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