作為遺傳物質(zhì)的DNA易受到機體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)攻擊造成氧化損傷,使生物體內(nèi)基因變異積累并可能引發(fā)基因組的不穩(wěn)定性,導致衰老、年齡相關(guān)性疾病(如神經(jīng)退行性疾病和腫瘤)的發(fā)生。8-羥基鳥嘌呤(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)是最為常見的DNA氧化損傷產(chǎn)物之一研究中經(jīng)常通過測定該產(chǎn)物水平來估測機體的氧化損傷程度。在DNA復(fù)制過程中8-OHdG傾向于與腺嘌呤(Adenine, A)而非胞嘧啶(Cytosine, C)配對,導致G:C→T:A的堿基顛換突變,是腫瘤、糖尿病等多種年齡相關(guān)性疾病的發(fā)病風險因素之一。 生物體內(nèi)普遍存在針對于DNA損傷的修復(fù)系統(tǒng)。其中,堿基切除修復(fù)系統(tǒng)(base excision repair, BER)是針對DNA氧化損傷的主要修復(fù)途徑。堿基切除修復(fù)系統(tǒng)是一個多步驟、涉及多種酶的過程,在人類,主要包括三種糖基化酶：MTH1(human MutT homolog-1)、OGG1(human8-OHdGuanine glycosylase)和MUTYH (human MutY hom...

【文章頁數(shù)】：115 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
英文縮寫與中文對照
前言
    參考文獻
第一部分 堿基切除修復(fù)基因變異與中國人群慢性腎功能衰竭發(fā)病風險的研究
    1.1 材料和方法
        1.1.1 研究對象
        1.1.2 主要儀器和試劑
        1.1.3 外周血DNA提取
        1.1.4 堿基切除修復(fù)基因變異的基因分型
            1.1.4.1 引物設(shè)計
G變異基因分型">            1.1.4.2 OGG1 c.977C>G變異基因分型
                1.1.4.2.1 高分辨率熔解曲線
G變異進行基因分型">                1.1.4.2.2 使用HRM對OGG1 c.977C>G變異進行基因分型
A變異基因分型">            1.1.4.3 MTH1 c.247G>A變異基因分型
C變異基因分型">            1.1.4.4 MUTYH c.972G>C變異基因分型
            1.1.4.5 MUTYH基因AluYb8插入基因分型
        1.1.5 基因變異位點基因分型樣本測序驗證
            1.1.5.1 瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物
            1.1.5.2 Bigdye反應(yīng)
            1.1.5.3 PCR產(chǎn)物沉淀
        1.1.6 統(tǒng)計分析
    1.2 結(jié)果
G變異基因分型結(jié)果">        1.2.1 OGG1 c.977C>G變異基因分型結(jié)果
A變異基因分型結(jié)果">        1.2.2 MTH1 c.247G>A變異基因分型結(jié)果
C變異基因分型結(jié)果">        1.2.3 MUTYH c.972 G>C變異基因分型結(jié)果
        1.2.4 AluYb8MUTYH變異基因分型結(jié)果
        1.2.5 堿基切除修復(fù)基因變異聯(lián)合分析與慢性腎功能衰竭發(fā)病風險
        1.2.6 堿基切除修復(fù)基因變異與慢性腎功能衰竭患者原發(fā)疾病及并發(fā)癥發(fā)病風險研究
第二部分 堿基切除修復(fù)基因變異與慢性腎功能衰竭患者DNA氧化損傷、慢性微炎癥的研究
    2.1 材料和方法
        2.1.1 研究對象
        2.1.2 主要儀器和試劑
        2.1.3 外周血白細胞DNA中8-OHdG的含量測定
            2.1.3.1 試劑配制
            2.1.3.2 鹽析法DNA提取
            2.1.3.3 ELISA法檢測基因組中8-OHdG含量
        2.1.4 血漿中IL-1β的含量測定
        2.1.5 血漿中IL-6的含量測定
        2.1.6 統(tǒng)計分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 慢性腎功能衰竭患者和對照組基因分型結(jié)果
        2.2.2 外周血白細胞DNA中8-OHdG含量檢測結(jié)果
        2.2.3 IL-1β含量檢測結(jié)果
        2.2.4 IL-6含量檢測結(jié)果
        2.2.5 IL-1β、IL-6含量與堿基切除修復(fù)基因變異聯(lián)合分析
    2.3 討論
    參考文獻
第三部分 MUTYH基因AluYb8插入變異影響原代培養(yǎng)成纖維細胞抗氧化應(yīng)激能力的研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 研究對象
        3.1.2 主要儀器和試劑
        3.1.3 人臍帶成纖維細胞的原代培養(yǎng)與鑒定
            3.1.3.1 實驗試劑的配制
            3.1.3.2 人臍帶成纖維細胞原代培養(yǎng)操作步驟
            3.1.3.3 人臍帶成纖維細胞原代培養(yǎng)的鑒定
            3.1.3.4 原代培養(yǎng)人臍帶成纖維細胞的AluYb8MUTYH基因型鑒定
                3.1.3.4.1 基因組DNA提取
                3.1.3.4.2 基因型鑒定
        3.1.4 線粒體膜電位的檢測
        3.1.5 成纖維細胞線粒體拷貝數(shù)檢測
        3.1.6 細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達
            3.1.6.1 KBrO3處理后不同基因型成纖維細胞
            3.1.6.2 蛋白提取與含量測定
            3.1.6.3 免疫印跡檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達
                3.1.6.3.1 主要試劑配制
                3.1.6.3.2 免疫印跡檢測蛋白表達
        3.1.7 統(tǒng)計分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 人臍帶成纖維細胞的原代培養(yǎng)與鑒定
            3.2.1.1 人臍帶成纖維細胞原代培養(yǎng)的鑒定
            3.2.1.2 AluYb8MUTYH變異基因分型
        3.2.2 線粒體膜電位的檢測
        3.2.3 線粒體拷貝數(shù)檢測
        3.2.4 細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達
    3.3 討論
    參考文獻
第四部分 結(jié)論
文獻綜述
    參考文獻
發(fā)表論文
致謝



本文編號：3942937