染色質(zhì)域解旋酶DNA結(jié)合蛋白5(chromodomain helicase DNA binding protein 5, CHD5)是人類腫瘤中一個(gè)重要的抑癌基因,是腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)的控制開關(guān),但是它在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用卻少有研究。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除前列腺癌細(xì)胞PC-3中CHD5基因,探索敲除CHD5基因?qū)C-3細(xì)胞增殖能力的影響。研究根據(jù)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)規(guī)則設(shè)計(jì)了3組特異性sgRNA,連接到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體。測(cè)序鑒定后將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒。包裝慢病毒滴度分別為CHD5-sgRNA-1 7.84×10⁹ TU/mL, CHD5-sgRNA-2 5.83×10 ⁹ TU/mL, CHD5-sgRNA-3 5.23×10⁹ TU/mL。用CHD5-sgRNA慢病毒感染PC-3細(xì)胞,嘌呤霉素篩選陽(yáng)性細(xì)胞,Western印跡檢測(cè)CHD5蛋白的表達(dá)水平,CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞周期檢測(cè)對(duì)PC-3細(xì)胞...

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 CHD5基因CRISPR/Cas9 打靶位點(diǎn)的選擇
    1.3 CRISPR/Cas9 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
    1.4 慢病毒的包裝與滴度測(cè)定
    1.5 慢病毒感染前列腺癌PC-3細(xì)胞
    1.6 細(xì)胞基因組DNA的提取及鑒定
    1.7 Western 印跡 檢測(cè)細(xì)胞中 CHD5在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)
    1.8 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖
    1.9 克隆形成能力檢測(cè)
    1.10 細(xì)胞周期檢測(cè)
    1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
    2.1 CRISPR/Cas9 表達(dá)載體的鑒定
    2.2 病毒滴度測(cè)定
    2.3 慢病毒CHD5-sgRNA-2和 CHD5-sgRNA-3感染PC-3細(xì)胞使CHD5蛋白表達(dá)下調(diào)
    2.4 慢病毒CHD5-sgRNA-2和 CHD5-sgRNA-3感染PC-3細(xì)胞后CHD5基因序列部分缺失
    2. 5 敲除CHD5促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖
    2.6 敲除CHD5導(dǎo)致PC-3細(xì)胞克隆形成能力增加
    2.7 敲除CHD5誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞G2/M期阻滯
    2.8 敲除CHD5 可調(diào)節(jié)G2/M相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)促進(jìn)PC-3細(xì)胞增殖
3 討論



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