本文關鍵詞：硫酸吲哚酚對單核細胞趨化功能的影響及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:成人慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)發(fā)病率逐年上升,多數(shù)國家超過10%,現(xiàn)已成為嚴重影響人類健康的全球公共衛(wèi)生問題。隨著CKD病情進展,部分患者將進入終末期腎病(End-stage renal disease,ESRD),體內大量尿毒癥毒素蓄積,只能靠血液凈化或腎移植維持生命。ESRD患者體內尿毒癥毒素蓄積,是導致尿毒癥狀況的根本原因。歐洲尿毒素研究組(European uremic toxin work group,EUTox)根據(jù)這些毒素的分子量大小及蛋白結合特性將其分為小分子水溶性物質(Free water-soluble low-molecular-weight solutes)(500Da)、蛋白結合毒素(Protein-bound uremic toxins,PBUTs)和中分子物質(Middle molecules)(500Da)三類。隨著透析技術的不斷改進,分子量小于20k Da的化合物,即大部分的小分子水溶性毒素和中分子毒素可被有效清除。然而,以硫酸吲哚酚(Indoxyl Sulfate,IS)為代表的PBUTs,因常與血漿中的蛋白質,尤其是與白蛋白(Human serum albumin,HSA)緊密結合而具有大分子物質的特性,現(xiàn)有的透析手段難以將其清除。心、腦血管事件是CKD患者的常見并發(fā)癥,即便是進入了維持性血液透析治療其發(fā)病率仍居高不下,成為導致透析患者死亡的主要原因�，F(xiàn)有的透析技術不能清除PBUTs,提示PBUTs可能與CKD患者心、腦血管事件的高發(fā)生率有著密切聯(lián)系。既往研究發(fā)現(xiàn),PBUTs的典型代表IS可損傷血管內皮細胞、促進血管平滑肌細胞增殖等,使受損的血管發(fā)生炎癥反應,釋放單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)等炎癥細胞因子,MCP-1可與單核/巨噬細胞表面的CC類趨化因子受體-2(C-C chemokine receptors 2,CCR2)特異性結合,進而激活并誘導外周血中單核/巨噬細胞向炎癥部位遷移、黏附、浸潤,加速動脈粥樣硬化的發(fā)生�？梢妴魏�/巨噬細胞在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中起著重要作用,而這一過程需要MCP-1等炎癥細胞因子及其受體的參與。既往關于PBUTs致動脈硬化的相關研究中,多集中于PBUTs損傷血管產生炎癥反應,進而激活、誘導外周血中的單核/巨噬細胞向炎癥部位黏附和浸潤。但PBUTs可否直接作用于單核/巨噬細胞,能否通過增強單核/巨噬細胞的趨化、遷移功能而加速動脈粥樣硬化等炎癥相關并發(fā)癥的進展,目前尚缺乏相關報道,有待于進一步研究。目的:本研究以thp-1人單核細胞作為研究對象,通過體外實驗觀察蛋白結合is和游離is對thp-1細胞趨化功能的影響及其可能機制,從而探討is與ckd患者動脈粥樣硬化及其他炎癥相關并發(fā)癥的關系。方法:1.體外配制不同濃度的蛋白結合is溶液(4%hsa+is100μmol/l,4%hsa+is200μmol/l,4%hsa+is400μmol/l,4%hsa+is800μmol/l),用30k的amiconultra-15離心過濾器超濾離心,以高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,hplc)檢測超濾液中游離is的含量,分別計算出is的游離率和蛋白結合率。2.體外培養(yǎng)thp-1細胞,分別以不同濃度的蛋白結合is(4%hsa+is100μmol/l,4%hsa+is200μmol/l,4%hsa+is400μmol/l,4%hsa+is800μmol/l)和游離is(is100,200,400,800μmol/l)處理12、24、48h后,以cck-8法對各組單核細胞進行增殖活性檢測。3.按實驗分組:空白對照組(pbs平衡溶液),陰性對照組(4%hsa溶液),蛋白結合is組(4%hsa+is200μmol/l),游離is組(is200μmol/l)處理thp-1細胞,進行transwell實驗,檢測蛋白結合is(4%hsa+is200μmol/l)和游離is(is200μmol/l)對thp-1細胞趨化功能的影響。4.將體外培養(yǎng)的thp-1細胞分別以蛋白結合is(4%hsa+is200μmol/l)和游離is(is200μmol/l)處理24h,以酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunoabsorbentassay,elisa)檢測細胞培養(yǎng)上清中mcp-1的濃度。5.將體外培養(yǎng)的thp-1細胞分別以蛋白結合is(4%hsa+is200μmol/l)和游離is(is200μmol/l)處理24h,流式細胞術檢測thp-1細胞表面ccr2的表達。結果:1.自制的不同濃度的蛋白結合is溶液(4%hsa+is100μmol/l,4%hsa+is200μmol/l,4%hsa+is400μmol/l,4%hsa+is800μmol/l)中is的游離率分別為:11.5%,12.8%,9.2%和7.85%,蛋白結合率分別為88.5%,87.2%,90.8%和92.15%。2.is對單核細胞增殖抑制作用的影響:(1)游離is對thp-1細胞的增殖具有抑制作用,隨著游離is的作用濃度增加,其對thp-1細胞的增殖抑制作用逐漸增強,具有濃度依賴性(p0.05);隨著游離is作用時間的延長,其對thp-1細胞的增殖抑制作用逐漸增強,具有時間依賴性(p0.05)。(2)蛋白結合is對thp-1細胞的增殖也具有抑制作用,隨著蛋白結合is作用濃度的增加,其對thp-1細胞的增殖抑制作用逐漸增強,大于200μmol/L的三個濃度組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義;同時,隨著蛋白結合IS作用時間的延長,其對THP-1細胞的增殖抑制作用逐漸增強,但作用24h后各時間點間無統(tǒng)計學差異。3.按實驗分組處理THP-1細胞24h后,趨化實驗結果顯示:空白對照組(PBS平衡溶液)平均穿膜細胞數(shù)為(13.2±5.6)個/視野;陰性對照組(4%HSA溶液)平均穿膜細胞數(shù)為(14.5±6.4)個/視野;蛋白結合IS組(4%HSA+IS 200μmol/L溶液)平均穿膜細胞數(shù)為(85.2±26.8)個/視野;游離IS組(IS 200μmol/L溶液)平均穿膜細胞數(shù)為(123.5±48.6)個/視野。與兩對照組相比,蛋白結合IS組和游離IS組趨化細胞數(shù)明顯增多,具有統(tǒng)計學差異(P0.05);兩實驗組間比較,游離IS組穿膜細胞數(shù)較蛋白結合IS組穿膜細胞數(shù)明顯增多,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.按實驗分組處理THP-1細胞24h,與兩對照組比較,游離IS組(IS 200μmol/L)和蛋白結合IS組(4%HSA+IS 200μmol/L)MCP-1濃度明顯升高,具有統(tǒng)計學差異(P0.05);兩實驗組間比較,游離IS組MCP-1濃度高于蛋白結合IS組,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.按實驗分組處理THP-1細胞24h,與兩對照組比較,游離IS組CCR2表達率明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);與陰性對照組比較,蛋白結合IS組的CCR2表達均增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);游離IS組與蛋白結合IS組之間比較,前者CCR2表達率明顯高于后者,具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。結論:蛋白結合IS和游離IS均對單核細胞具有增殖抑制作用,且呈濃度依賴性;蛋白結合IS同游離IS一樣,可上調MCP-1和CCR2的表達,進而增強單核細胞的趨化功能;由于循環(huán)中蛋白結合的IS是游離IS的9倍,所以其對單核細胞趨化功能的影響更應引起高度重視;設法解離與白蛋白結合的IS,增加IS的透析清除率,對CKD患者的長期預后可能有利。
【關鍵詞】：蛋白結合毒素 硫酸吲哚酚 單核細胞
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 前言13-15
• 材料與方法15-24
• 結果24-33
• 討論33-36
• 全文結論36-37
• 參考文獻37-43
• 文獻綜述 蛋白結合尿毒素心血管毒性的研究進展43-55
• 參考文獻48-55
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文55-56
• 致謝56

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