精子發(fā)生包括原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells,PGCs)形成、遷移、增殖和分化,性原細(xì)胞增殖、靜息和遷移,精原(干)細(xì)胞自我更新和分化,精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精細(xì)胞變態(tài)形成精子一系列連續(xù)過(guò)程。其中任何一步發(fā)生異常,都會(huì)導(dǎo)致精子畸形、運(yùn)動(dòng)能力下降或數(shù)目減少(如臨床上常見(jiàn)的畸、弱、少精子癥),乃至無(wú)法形成(即臨床上常見(jiàn)的無(wú)精子癥),從而引發(fā)男性不育。男性不育影響約7%的男性。遺傳因素可能是生精障礙的主要原因,但在大多數(shù)病例中,其發(fā)病病因仍不清楚。本論文對(duì)一個(gè)巴基斯坦近親結(jié)婚后代發(fā)生男性不育的家系進(jìn)行研究,以期揭示其不育的原因。父母為表兄妹結(jié)婚,生育四個(gè)兒子,其中三個(gè)不育,兩位為少弱精子癥患者,另一位是無(wú)精子癥患者。通過(guò)全外顯子組和Sanger測(cè)序,篩選到范可尼貧血(Fanconi Anemia,FA)核心復(fù)合物成分FANCM的一個(gè)移碼突變(c.1946_₁958del,p.P648Lfs*16)與不育癥共分離,認(rèn)為是該家系不育患者的潛在致病突變。因?yàn)镕ANCM參與DNA鏈間交聯(lián)(interstrandcrosslink,ICL)損傷修復(fù),所以我們檢...

【文章頁(yè)數(shù)】：125 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 引言
    1.2 精子發(fā)生
        1.2.1 生殖細(xì)胞命運(yùn)決定
        1.2.2 原始生殖細(xì)胞遷移和存活
        1.2.3 性原細(xì)胞增殖、靜息和遷移
        1.2.4 精原細(xì)胞自我更新和分化
        1.2.5 精母細(xì)胞減數(shù)分裂
        1.2.6 精子形成
    1.3 范可尼貧血與DNA鏈間交聯(lián)修復(fù)
        1.3.1 范可尼貧血
        1.3.2 DNA鏈間交聯(lián)產(chǎn)生原因和結(jié)果
        1.3.3 FA通路與鏈間交聯(lián)修復(fù)
        1.3.4 FA通路的其他作用
        1.3.5 FA通路與其他修復(fù)機(jī)制的交互作用
    1.4 FANCM的功能
        1.4.1 FANCM在FA通路的功能
        1.4.2 FANCM的獨(dú)特作用
        1.4.3 FANCM與Bloom綜合征的關(guān)系
        1.4.4 FANCM激活DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)而不依賴FA通路
        1.4.5 FANCM在復(fù)制叉重塑中的作用
第2章 實(shí)驗(yàn)材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 小鼠信息
        2.1.2 細(xì)胞系及菌種
        2.1.3 質(zhì)粒載體
        2.1.4 引物序列
        2.1.5 抗體信息
        2.1.6 耗材及試劑
        2.1.7 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.8 溶液配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 病例收集
        2.2.2 全外顯子組測(cè)序
        2.2.3 外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體斷裂分析
        2.2.4 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        2.2.6 構(gòu)建FANCM^-/-穩(wěn)定的293T細(xì)胞系
        2.2.7 外源導(dǎo)入FANCM回補(bǔ)內(nèi)源FANCM敲除實(shí)驗(yàn)
        2.2.8 免疫熒光
        2.2.9 Western Blot
        2.2.10 RNA抽提
        2.2.11 RT-PCR
        2.2.12 基因敲除小鼠制備
        2.2.13 小鼠生育力檢測(cè)
        2.2.14 睪丸組織包埋及切片
        2.2.15 組織切片蘇木精伊紅染色(HE)
        2.2.16 組織切片免疫熒光染色
        2.2.17 小鼠精母細(xì)胞鋪展及染色
        2.2.18 BrdU染色
        2.2.19 TUNEL檢測(cè)
        2.2.20 精子計(jì)數(shù)
        2.2.21 精原細(xì)胞中期染色體斷裂分析
        2.2.22 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
    3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1.1 巴基斯坦近親結(jié)婚家系中男性不育的臨床表型
        3.1.2 巴基斯坦家系不育患者中篩選并確定FANCM純合移碼突變
        3.1.3 FANCM突變導(dǎo)致患者染色體斷裂修復(fù)缺陷但不導(dǎo)致骨髓衰竭
        3.1.4 FANCM突變功能缺失損害FA通路
        3.1.5 FANCM突變降低細(xì)胞存活率
        3.1.6 Fancm△^C/△C
小鼠無(wú)骨髓衰竭
        3.1.7 Fancm△^C/△C
雄性小鼠生育力降低
        3.1.8 Fancm△^C/△C
雄性小鼠精子發(fā)生異常
        3.1.9 Fancm△^C/△C
雄性小鼠出生前后生殖細(xì)胞增殖減少
        3.1.10 FANCM突變與精子變形階段DNA斷裂修復(fù)
    3.2 討論
參考文獻(xiàn)
攻讀博士期間的主要學(xué)習(xí)成果
致謝
附錄1 預(yù)測(cè)突變的有害性的軟件列表



本文編號(hào)：3781399

boshi