目的：E-鈣粘蛋白（E-cadherin, E-cad）質(zhì)粒（pIRES2-EGFP-ECAD）轉(zhuǎn)染人腹膜間皮細(xì)胞永生化細(xì)胞株（HMrSV5）,觀察E-cad的過表達(dá)對腹膜間皮細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）的影響。方法：（1）采用大腸桿菌DH5α進(jìn)行pIRES2-EGFP-ECAD質(zhì)粒及空白質(zhì)粒（Vector）擴(kuò)增,酶切鑒定,RT-PCR驗(yàn)證。（2）體外培養(yǎng)HMrSV5,將HMrSV5分為正常對照組、E-cad轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（lip LTX）轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-ECAD質(zhì)粒及空質(zhì)粒,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；流式細(xì)胞術(shù)評估轉(zhuǎn)染效率,采用RT-PCR、Western Blot分別觀察轉(zhuǎn)染后12h、24h、36h、48h、72h E-cad的mRNA及蛋白表達(dá)。（3）將HMrSV5分為正常對照組、TGF-β刺激組,采用Western Blot.細(xì)胞免疫熒光觀察TGF-p刺激后12h、24h、36h、48h E-cad、 α-SMA的蛋白表達(dá)；驗(yàn)證iur-β刺激對HMrSV5E... 

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
1 前言
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 主要儀器
        2.1.2 菌株及質(zhì)粒
        2.1.3 細(xì)胞株
        2.1.4 主要試劑與耗材
        2.1.5 主要配制溶液
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)菌的制備
        2.2.2 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
        2.2.3 質(zhì)粒抽提
        2.2.4 質(zhì)粒菌種保存
        2.2.5 抽提產(chǎn)物的鑒定
        2.2.6 細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)
        2.2.7 細(xì)胞消化傳代
        2.2.8 細(xì)胞凍存
        2.2.9 細(xì)胞計(jì)數(shù)
        2.2.10 細(xì)胞轉(zhuǎn)染(以E-cad質(zhì)粒轉(zhuǎn)染為例)
        2.2.11 實(shí)驗(yàn)分組
        2.2.12 熒光顯微鏡下觀察GEFP的表達(dá)及轉(zhuǎn)染率的計(jì)算
        2.2.13 流式細(xì)胞術(shù)評估轉(zhuǎn)染率
        2.2.14 基因水平檢測
        2.2.15 蛋白水平的檢測
    2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 E-cad質(zhì)粒酶切電泳及RT-PCR檢測結(jié)果
        3.1.1 酶切電泳鑒定結(jié)果
        3.1.2 RT-PCR檢測結(jié)果
    3.2 pIRES2-EGFP-ECAD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率評估
        3.2.1 pIRES2-EGFP-ECAD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HMrSV5后GEFP的表達(dá)情況
        3.2.2 pIRES2-EGFP-ECAD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HMrSV5后轉(zhuǎn)染率統(tǒng)計(jì)
    3.3 pIRES2-EGFP-ECAD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HMrSV5對E-cad mRNA及蛋白的影響
    3.4 TGF-β誘導(dǎo)HMrSV5細(xì)胞EMT的發(fā)生
    3.5 過表達(dá)E-cad對TGF-β刺激HMrSV5細(xì)胞E-cad、α-SMA、Vimentin表達(dá)影響
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間主要研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]E-鈣黏蛋白（E-cadherin）對人滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力及妊娠結(jié)局的影響[J]. 趙洪波,薛立榮,李大金.  生殖與避孕. 2012(01)
[2]EMT在腹膜纖維化中的作用及意義[J]. 鄒莎琳,凌光輝,夏運(yùn)成,袁曙光,彭佑銘,孫林,劉伏友.  中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志. 2009(07)
[3]腹膜透析腹膜纖維化的機(jī)制及防治[J]. 劉伏友.  中國血液凈化. 2007(12)
[4]陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染機(jī)制及轉(zhuǎn)染效率影響因素[J]. 陳彥祥,喬衛(wèi)紅,劉棟良,李宗石.  生物工程學(xué)報(bào). 2007(05)
[5]轉(zhuǎn)化生長因子β1對人腹膜間皮細(xì)胞結(jié)締組織生長因子的影響[J]. 張浩,劉伏友,劉映紅,廖琴,龍志高,吳鼎文,敖翔,陳仙花.  中華腎臟病雜志. 2004(04)



本文編號：3652960