目的:（1）選擇必需脂肪酸α-亞麻酸/亞油酸（ALA/LA）,干預(yù)人腎近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）高糖損傷模型,闡明ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞的體外保護(hù)作用及其機(jī)制;（2）探明ALA/LA對(duì)糖尿病腎�。―N）db/db小鼠的各種生物學(xué)效應(yīng),闡明ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠的體內(nèi)保護(hù)作用及其可能的機(jī)制;（3）通過(guò)離體和在體實(shí)驗(yàn),闡明DN發(fā)展過(guò)程中,ALA/LA對(duì)腎臟炎性水平、氧化應(yīng)激以及腎小管纖維化等方面的作用及可能機(jī)制,為應(yīng)用ALA/LA防治DN,提供實(shí)驗(yàn)積累和應(yīng)用基礎(chǔ)。方法:（1）高糖刺激建立HK-2細(xì)胞糖損傷模型和db/db小鼠DN模型;（2）生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、病理生理學(xué)方法,觀察ALA/LA的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果:（1）ALA/LA干預(yù)組HK-2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收能力高于對(duì)照組（p<0.05）,干預(yù)組細(xì)胞因子水平和氧化應(yīng)激損傷以及細(xì)胞凋亡率低于高糖模型組（p<0.05）;（2）ALA/LA干預(yù)組HK-2細(xì)胞TGF-β1、p38mRNA以及TGF-β1、p-p38蛋白表達(dá)量均顯著低于高糖模型組（p<0.05）;（3）經(jīng)ALA/LA干預(yù)后... 

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前言
第一章 ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞的作用及其機(jī)制探討
    第一節(jié) HK-2細(xì)胞糖損傷模型的建立
        1 材料
            1.1 建模細(xì)胞
            1.2 主要試劑及溶液配置
            1.3 主要儀器和設(shè)備
        2 方法
            2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理
            2.2 葡萄糖影響HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)的檢測(cè)(MTT比色法)
            2.3 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 不同培養(yǎng)時(shí)間和葡萄糖濃度對(duì)HK-2細(xì)胞存活率的影響
            3.2 不同培養(yǎng)時(shí)間和葡萄糖濃度對(duì)HK-2細(xì)胞存活率的影響
        4 討論
            4.1 MTT法的應(yīng)用
            4.2 不同培養(yǎng)時(shí)間,葡萄糖濃度對(duì)HK-2細(xì)胞存活率的影響
            4.3 最適培養(yǎng)時(shí)間,葡萄糖濃度對(duì)HK-2細(xì)胞存活率的影響
        5 結(jié)論
    第二節(jié) ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞葡萄糖吸收功能的影響
        1 材料
            1.1細(xì)胞與ALA,LA,EPA
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2 ALA/BSA, LA/BSA, ALA/LA/BSA溶液制備
            2.3 實(shí)驗(yàn)分組
            2.4 測(cè)定細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收(GOD-POD法)
            2.5 葡萄糖吸收率的計(jì)算
            2.6 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 ALA/LA可以降低HK-2細(xì)胞培養(yǎng)液葡萄糖含量
            3.2 ALA/LA促進(jìn)HK-2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收
        4 討論
            4.1 ALA/LA對(duì)HK-2細(xì)胞培養(yǎng)液葡萄糖含量的影響
            4.2 ALA/LA對(duì)HK-2細(xì)胞葡萄糖吸收的影響
        5 結(jié)論
    第三節(jié) ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
        1 材料
            1.1 細(xì)胞與ALA,LA,EPA
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 HK-2細(xì)胞總超氧化物歧化酶(T-SOD)的測(cè)定
            2.2 HK-2細(xì)胞谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)的測(cè)定
            2.3 HK-2細(xì)胞過(guò)氧化氫酶(CAT)的檢測(cè)
            2.4 HK-2細(xì)胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH-PX)的檢測(cè)
            2.5 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 ALA/LA提升糖損傷HK-2細(xì)胞的SOD水平
            3.2 ALA/LA提升糖損傷HK-2細(xì)胞GSH-PX水平
            3.3 ALA/LA提升糖損傷HK-2細(xì)胞CAT水平
            3.4 ALA/LA降低糖損傷HK-2細(xì)胞NADPH-PX水平
        4 討論
            4.1 ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性的影響
            4.2 ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活性影響
            4.3 ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響
            4.4 ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH-PX)活性的影響
        5 結(jié)論
    第四節(jié) ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞因子的影響
        1 材料
            1.1 HK-2細(xì)胞和ALA,LA,EPA
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 HK-2細(xì)胞TGF-p1水平的測(cè)定
            2.2 HK-2細(xì)胞IGF-1水平的測(cè)定
            2.3 HK-2細(xì)胞MCP-1水平的測(cè)定
            2.4 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 ALA/LA降低糖損傷HK-2細(xì)胞的IGF-1水平
            3.2 ALA/LA降低糖損傷HK-2細(xì)胞的TGF-β_1水平
            3.3 ALA/LA降低糖損傷HK-2細(xì)胞的MCP-1水平
            3.4 ALA/LA降低糖損傷HK-2細(xì)胞的MCP-1、TGF-β_1mRNA水平
        4 討論
            4.1 ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞IGF-1水平的影響
            4.2 ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞TGF-β_1水平的影響
            4.3 ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞MCP-1水平的影響
        5 結(jié)論
    第五節(jié) ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞ROS生成及細(xì)胞凋亡的影響
        1 材料
            1.1 細(xì)胞和ALA, LA, EPA
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器和設(shè)備
        2 方法
            2.1 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2 溶液制備
            2.3 HK-2細(xì)胞ROS水平檢測(cè)
            2.4 HK-2細(xì)胞凋亡檢測(cè)
            2.5 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 ALA/LA抑制糖損傷HK-2細(xì)胞ROS生成
            3.2 ALA/LA抑制糖損傷HK-2細(xì)胞凋亡
        4 討論
            4.1 ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞ROS生成的影響
            4.2 高糖刺激與ALA/AL對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響
        5 結(jié)論
    第六節(jié) ALA/LA對(duì)糖損傷HK-2細(xì)胞P38通路及TGF-β_1 mRNA表達(dá)的影響
        1 材料
            1.1 細(xì)胞和ALA, LA, EPA
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2 方法
            2.1 HK-2細(xì)胞p38、TGF-β_1mRNA表達(dá)的檢測(cè)
            2.2 HK-2細(xì)胞p38/p-p38、TGF-β_1蛋白表達(dá)的檢測(cè)
            2.3 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 ALA/LA降低糖損傷HK-2細(xì)胞TGF-β_1和p38 MAPK的mRNA表達(dá)量
            3.2 ALA/LA降低糖損傷HK-2細(xì)胞p38和TGF-β_1的蛋白表達(dá)量
        4 討論
            4.1 p38信號(hào)通路與TGF-β_1及DN的發(fā)生發(fā)展
            4.2 ALA/LA干預(yù)高糖HK-2細(xì)胞對(duì)TGF-β_1、p38及p-p38蛋白表達(dá)量的影響
        5 結(jié)論
第二章 ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠的作用及機(jī)制探討
    第一節(jié) db/db小鼠與DN動(dòng)物模型構(gòu)建
        1 材料
            1.1 db/db小鼠和db/m小鼠
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2 方法
            2.1 分組與建模
            2.2 日飲水量測(cè)定
            2.3 日攝食量測(cè)定
            2.4 24h尿量測(cè)定
            2.5 24h尿白蛋白測(cè)定
            2.6 空腹血糖測(cè)定
            2.7 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 各組小鼠日飲水量比較
            3.2 各組小鼠日攝食量比較
            3.3 各組小鼠24h尿白蛋白含量的比較
            3.4 各組小鼠24h尿量的比較
            3.5 各組小鼠空腹血糖(FBG)的比較
            3.6 各組小鼠體重的比較
        4 討論
            4.1 db/db小鼠的生物學(xué)特征
            4.2 DN模型判斷
        5 結(jié)論
    第二節(jié) ALA/LA干預(yù)對(duì)DN db/db小鼠的作用
        1 材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與ALA,LA
            1.2 飼料配方
            1.4 主要儀器
        2 方法
            2.1 觀察動(dòng)物生長(zhǎng)情況
            2.2 標(biāo)本收集與處理
            2.3 血糖測(cè)走
            2.4 腎功能測(cè)定
            2.5 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 ALA/LA降低DN db/db小鼠體重
            3.2 ALA/LA降低DN db/db小鼠空腹血糖(FBG)
            3.3 ALA/LA降低DN db/db小鼠臟體比
            3.4 ALA/LA改善DN db/db小鼠的腎功能
            3.5 ALA/LA降低DN db/db小鼠血液炎性因子TNF-α、IGF-1的水平
        4 討論
            4.1 ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠體重的影響
            4.2 ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠空腹血糖(FBG)的影響
            4.3 ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠臟體比的影響
            4.4 ALA/LA改善DN db/db小鼠腎功能的影響
            4.5 ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠分泌炎癥因子的作用
        5 結(jié)論
    第三節(jié) ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠腎臟氧化應(yīng)激水平的影響
        1 材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與ALA,LA
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器與設(shè)備
        2 方法
            2.1 8-羥基脫氫鳥(niǎo)苷(8-OHDG)測(cè)定
            2.2 小鼠腎臟組織T-SOD測(cè)定
            2.3 小鼠腎臟組織過(guò)氧化氫酶(CAT)的檢測(cè)
            2.4 小鼠腎臟組織丙二醛(MDA)的檢測(cè)
            2.5 小鼠腎臟組織活性氧簇(ROS)的檢測(cè)
            2.6 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 ALA/LA抑制DN db/db小鼠腎臟生成氧化應(yīng)激產(chǎn)物8-OHDG和MDA
            3.2 ALA/LA可提高DN db/db小鼠腎臟組織抗氧化酶SOD和CAT活性
            3.3 ALA/LA能夠抑制DN db/db小鼠腎臟組織ROS生成
        4 討論
            4.1 ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠尿8-OHDG和腎組織MDA水平的影響
            4.2 ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠腎臟組織SOD和CAT的影響
            4.3 ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠腎臟組織ROS生成量的影響
        5 結(jié)論
    第四節(jié) ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠肝臟和腎臟病理形態(tài)學(xué)的影響
        1 材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和ALA、LA
            1.2 主要試劑及溶液配制
            1.3 主要儀器和設(shè)備
        2 方法
            2.1 蘇木素-伊紅(Hematoxin Eosin, HE)染色實(shí)驗(yàn)
            2.2 過(guò)碘酸雪夫(Periodic Acid Schiff,PAS)染色
            2.3 馬松三色染色(Masson's Trichrom Stain)
            2.4 電鏡樣品制作步驟
            2.5 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 ALA/LA可以減輕DN db/db小鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)損傷
            3.3 ALA/LA能夠減輕DN db/db小鼠腎臟病理PAS染色形態(tài)學(xué)損傷
            3.4 ALA/LA減輕DN db/db小鼠腎臟Masson染色病理形態(tài)學(xué)損傷
            3.5 ALA/LA改善DN db/db小鼠電鏡下腎臟病理形態(tài)學(xué)的損傷
        4 討論
            4.1 光鏡病理切片HE、Masson和PAS染色的差別和意義
            4.2 ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)(光鏡HE染色)的影響
            4.3 ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠腎臟病理切片HE、PAS、Masson染色形態(tài)學(xué)的影響
            4.4 ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠腎臟電鏡病理形態(tài)學(xué)損傷的影響
        5 結(jié)論
    第五節(jié) ALA/LA對(duì)DN db/db小鼠腎組織纖維化的作用及機(jī)制探討
        1 材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和ALA、LA
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器與設(shè)備
        2 方法
            2.1 Realtime PCR
            2.2 Westen-Blot
            2.3 數(shù)據(jù)處理
        3 結(jié)果
            3.1 ALA/LA抑制TGF-β_1、P38、ERK和COLⅣmRNA的表達(dá)
            3.2 低劑量ALA/LA降低腎臟組織TGF-β_1、p-p38、p-ERK和COLⅣ蛋白的表達(dá)
        4 討論
            4.1 MAPKs與DN的發(fā)生發(fā)展
            4.2 ALA/LA抑制P38通路,下調(diào)TGF-β_1、COLⅣ蛋白表達(dá),抑制DN db/db小鼠的纖維化發(fā)展
            4.3 ALA/LA抑制ERK信號(hào)通路,下調(diào)TGF-β_1、COLⅣ蛋白表達(dá),減慢DN db/db小鼠的纖維化發(fā)展
        5 結(jié)論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]NADPH氧化酶與糖尿病腎病[J]. 蔡娜娜,劉寬芝.  國(guó)際泌尿系統(tǒng)雜志. 2014 (03)
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碩士論文
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本文編號(hào)：3652542